综述：量化c-di-GMP：整合生物学与化学方法之倡议

《Applied Microbiology》：Quantifying c-di-GMP: A Call for Integration of Biological and Chemical Approaches

　　

细菌通过高度敏感的胞内网络感知、响应并适应快速变化的环境。其中，环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP，c-di-GMP）是一种被充分表征的第二信使，控制着从浮游态向固着态生活方式的转变，使其成为细菌适应与存活的关键决定因素。目前已发展出两种主要方法来研究c-di-GMP的动态变化。第一种方法利用生物传感器，通过转录报告子、RNA传感器或蛋白质传感器对活细胞内c-di-GMP进行实时监测。其主要优势在于能够在活细胞中进行实时、时空分析，但通常无法提供绝对定量。第二种方法依赖于分析化学，尤其是液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry，LC-MS/MS），该方法能够在多种细菌物种中实现胞内c-di-GMP的高灵敏度和准确量化。然而，缺乏标准化的提取方案以及细胞裂解的需求阻碍了实时测量，仅能提供总c-di-GMP库的静态快照。这两种方法具有互补性：生物传感器揭示动态的单细胞响应，而LC-MS/MS则提供精确的整体定量。尽管如此，大多数研究仅依赖其中一种方法，限制了对c-di-GMP生物学特性的全面理解。将两种方法结合将为c-di-GMP信号传导及其在细菌生理学中的作用提供更全面的视角。

2. 通过生物传感器工具进行活体定量

该部分介绍了基于不同检测机制开发的多种c-di-GMP生物传感器，包括转录生物传感器、调控RNA生物传感器和蛋白质生物传感器。

2.1 转录生物传感器

转录生物传感器利用c-di-GMP依赖性启动子（如cdrA基因启动子）驱动绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）表达。c-di-GMP通过解除FleQ阻遏蛋白对启动子的抑制，使GFP产量与胞内c-di-GMP水平成正比。该传感器已用于研究抗生物膜分子的作用机制，例如鉴定出通过激活BifA磷酸二酯酶降解c-di-GMP的化合物H6-335和H6-335-P1。此外，该传感器还揭示了Psl多糖对c-di-GMP合成的直接促进作用，以及流体剪切力等机械刺激诱导c-di-GMP合成的能力。为克服GFP半衰期较长（约26小时）的限制，研究者开发了不稳定的GFP-ASV变体，从而能够监测生物膜内c-di-GMP产生的异质性。转录生物传感器保持细胞完整性，支持实时监测，但由于转录-翻译级联存在固有延迟，难以实现瞬时测量和亚细胞定位。

2.2 调控RNA生物传感器

核糖开关（riboswitch）是位于mRNA 5′非翻译区的顺式作用元件，包含配体结合的适体区和调节基因表达的表达平台。研究者将c-di-GMP特异性适体（如源自Vibrio cholerae的Vc2适体）与Spinach适体融合，当c-di-GMP结合时稳定Spinach模块，使DFHBI产生荧光。该系统具有高特异性，对cGMP或c-di-AMP-GMP等结构类似物无响应，检测限低至320 nM。另一策略是利用c-di-GMP响应适体调控荧光蛋白编码基因的转录，如源自Bacillus licheniformis的lchAA适体调控黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Protein，YFP）表达，用于监测Bacillus subtilis中c-di-GMP水平随生理状态的变化。RNA生物传感器灵敏度高、特异性强，但高灵敏度可能导致饱和，不适合天然c-di-GMP水平较高的细菌（如Pseudomonas aeruginosa）。为此，研究者开发了基于三串联适体（Bc3-Bc4-Bc5）的系统，扩展了动态范围。此外，Spinach-DFHBI系统无需荧光蛋白合成，适合厌氧菌研究，但DFHBI积累效应和复合物降解动力学尚未完全表征。

2.3 蛋白质生物传感器

蛋白质生物传感器基于共振能量转移（Resonance Energy Transfer，RET）原理，包括荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）、生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）和化学发光共振能量转移。FRET系统利用供体荧光蛋白（如青色荧光蛋白，CFP）与受体荧光蛋白（如黄色荧光蛋白，YFP）之间的能量转移。首个FRET-based c-di-GMP传感器基于Salmonella enterica的YcgR蛋白（含PilZ结构域），c-di-GMP结合引起构象变化使供受体分离，降低FRET效率。该传感器揭示了Caulobacter crescentus不对称分裂中c-di-GMP在柄细胞中的积累，以及P. aeruginosa细胞周期中c-di-GMP在非鞭毛极的极化分布。BRET系统使用荧光素酶（如Nanoluc）作为能量供体，避免了光漂白和细胞自发荧光问题，灵敏度可达30 fmol。双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC）技术将荧光蛋白分裂为两个非荧光片段，分别融合至c-di-GMP结合蛋白（如BldD），c-di-GMP结合促使片段重组产生荧光。最新发展的CdGreen和CdGreen2传感器基于环状排列的增强型绿色荧光蛋白（circularly permutated EGFP，cpEGFP），CdGreen2通过突变将解离常数（K_d）从386 nM提高至1.83 μM，加速了解离动力学，能够在单细胞水平以5分钟间隔实时监测c-di-GMP波动，持续数小时。

3. 通过分析化学方法测定c-di-GMP

该部分阐述了利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行c-di-GMP绝对定量的方法，涵盖提取方案和检测参数。

3.1 提取方法

c-di-GMP提取前必须进行代谢淬灭以终止酶活性。培养条件（如培养基类型和取样时间）影响提取效果，LB培养基可能产生与c-di-GMP共洗脱的干扰物，建议使用Vogel-Bonner Minimal Media（VBMM）培养基。c-di-GMP水平随生长阶段变化，指数期上升，稳定期初期达峰后下降。主要提取方法分为三类：热处理提取（100°C加热3分钟，冷乙醇萃取）、高氯酸提取（冷酸裂解后需用K₂CO₃或KHCO₃中和）以及有机溶剂结合加热提取（乙腈/甲醇/水2:2:1混合液）。有机溶剂法因与LC-MS/MS兼容性最佳而被广泛采用。内标的使用至关重要，常用¹³C₂₀¹⁵N₁₀标记的c-di-GMP或黄苷3′,5′-环磷酸（cXMP）。文献中提取回收率报道不一（62-110%），缺乏系统的计量学表征是当前方法比较的主要障碍。

3.2 液相色谱-质谱法定量与纯化c-di-GMP

液相色谱采用C18反相柱，以极性溶剂（如乙酸铵水溶液和甲醇或乙腈）进行梯度洗脱，实现c-di-GMP与其他胞内代谢物的分离。检测采用电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI）和三重四极杆串联质谱，在多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式下进行。c-di-GMP的母离子为m/z 691，定量离子为m/z 691→152，定性离子为m/z 691→248（高特异性）和m/z 691→540。碰撞能量优化为20 V。检测限范围为0.002-2.5 nmol/mL，定量限为0.006-5 nmol/mL。该方法还可同时检测c-di-AMP、pGpG、pApA及单核苷酸等代谢物。此外，基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）技术能够实现生物膜内c-di-GMP空间分布的可视化，无需标记。商业化的ELISA试剂盒（Cayman Chemical）检测限为5.3 pg/mL，可作为替代方案。

4. 讨论

生物传感器和LC-MS/MS各有优劣。生物传感器适合监测活细胞中的实时动态和空间分布，但通常仅提供相对测量，灵敏度受生物噪声限制，且在不同物种间应用需大量优化。LC-MS/MS提供高灵敏度的绝对定量，适用于多种细菌物种，但需要细胞裂解，仅提供群体平均值，无法解析单细胞异质性和空间分布。c-di-GMP信号具有高度动态性和空间组织性，局部产生、降解和隔离可形成异质性的c-di-GMP库。目前尚无单一方法能同时实现高灵敏度绝对定量和实时空间分辨。提取方案的标准化（包括回收率报告和归一化参数定义）是提高跨研究可比性的关键。未来进展应依赖于整合互补方法，将LC-MS/MS的绝对定量与生物传感器的时空动态观测相结合。

5. 结论

生物传感器适合研究活细胞中c-di-GMP的时空动态，但灵敏度和普适性有限；LC-MS/MS提供高灵敏度和广泛适用性的绝对定量，但无法解析亚细胞定位和实时动态。将两种互补方法结合或开发整合生物传感器可视化与分析定量的混合工具，将是全面阐明c-di-GMP在细菌生理学和信号传导中作用的关键。