靶向LKB1失活型肺癌的CRTC-CREB通路钉合肽抑制剂

《Molecular Therapy Oncology》：Targeting LKB1-inactivated lung cancers with a stapled peptide inhibitor of the CRTC-CREB pathway

　　

非小细胞肺癌（NSCLC）中肿瘤抑制因子LKB1失活的病例常见且对现有疗法反应差。研究人员此前确定CRTC-CREB转录通路的异常激活是LKB1缺陷肺癌恶性的关键驱动因素。本研究开发了稳定的α-螺旋肽，称为CREB结合域稳定α-螺旋体（SAH-CBDs），旨在破坏CRTC-CREB蛋白-蛋白相互作用。SAH-CBD肽采取稳定的生物活性α-螺旋构象，直接结合CREB，并在体外有效阻断CRTC-CREB复合物形成。重要的是，SAH-CBDs在不引起膜破坏的情况下穿透细胞，抑制CREB依赖的转录，并选择性抑制LKB1-null肺癌细胞生长，对LKB1野生型细胞影响极小。这些发现确立SAH-CBDs作为机制研究工具及针对LKB1失活NSCLC中关键转录弱点的原型治疗药物。

研究背景：肺癌是全球癌症死亡首要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%，而LKB1（亦称STK11）失活发生于高达30%肺腺癌，是预后差、对化疗及免疫检查点抑制剂应答弱的第三大频发性变异，目前无有效靶向手段。LKB1作为主控激酶激活AMPK及相关激酶SIK1/3，其缺失致SIK功能受损、CRTC1/2/3去磷酸化入核，与CREB的bZIP结构域结合于cAMP响应元件（CRE）上，驱动促生存/增殖转录程序。该SIK-CRTC-CREB轴是LKB1失活核心效应通路。既往研究人员用显性负性CRTC（dnCRTC）基因工具验证该界面为弱点，但需基因递送难转化临床。靶向胞内蛋白-蛋白相互作用（PPI）的肽面临构象丢失与透膜差难题；碳氢钉合（hydrocarbon stapling）技术通过引入带烯烃侧链非天然氨基酸并经关环复分解形成跨两圈α-螺旋的烃桥，可稳定螺旋、抗蛋白酶解、改善摄取，适合干预“不可成药”转录复合物。本研究据此将遗传证据转为药理工具。

主要关键技术方法：基于CRTC2:CREB:CRE晶体结构（PDB:5ZKO）选取CRTC2 CBD第19–44位氨基酸设计钉合肽SAH-CBD系列；采用固相Fmoc合成、Grubbs一代催化剂关环复分解制备碳氢钉合肽；圆二色光谱（CD）定量α-螺旋度；荧光偏振（FP）与电泳迁移率变动分析（EMSA）在体外评估CREB结合及CRTC-CREB-DNA三元复合物破坏；以人LKB1-null NSCLC细胞（A549、H157、H1437）、LKB1-WT NSCLC（H322）及永生化支气管上皮BEAS-2B为细胞模型，结合FITC标记肽显微摄取、LDH释放评估膜毒性、哺乳动物双杂交荧光素酶报告、CellTiter-Glo/台盼蓝计数、Annexin V/PI流式、RT-qPCR及RNA-seq与GSEA转录组分析。

研究结果：

Design and synthesis of stapled α-helical CBD peptides：依据5ZKO结构选CRTC2 CBD 19–44序列，在i,i+7非作用面引入(R)-2-(7-辛烯基)丙氨酸与(S)-2-(4-戊烯基)丙氨酸，钉合后CD显示SAH-CBD-5/6螺旋度高，成功获得稳定α-螺旋模拟肽。

SAH-CBD peptides bind CREB and disrupt the CRTC-CREB-DNA complex：FP中FITC-SA-H-CBD-5/6与GST-CREB bZIP低纳摩尔EC₅₀结合；竞争FP示其IC₅₀较未钉合WT-CBD低5–10倍；EMSA中SAH-CBD-6在10:1摩尔比抑三元复合物约90%并稳定CREB-DNA，证实直接打断CRTC-CREB界面。

Peptide stapling enables the cellular uptake of lead SAH-CBD peptides：1μM FITC-SA-H-CBD-5/6处理LKB1-null细胞4h可见胞内弥散荧光，1h至24h持续；LDH释放与Triton X-100阳性对照比无升高，证明钉合赋予透膜性而非膜溶解。

SAH-CBD-6 reduces the cellular CRTC-CREB interaction and suppresses cell growth in LKB1-null lung cancer cells：哺乳动物双杂交中SAH-CBD-6（3.3–30μM）剂量依赖抑CRTC2驱动荧光素酶；CellTiter-Glo示LKB1-null细胞IC₅₀显著低于H322/BEAS-2B；台盼蓝证实96h生长抑制，RT-qPCR示LINC00473、INSL4、CPS1下调，Wnt/p53靶基因不变，显示选择性转录干预。

SAH-CBD-6 suppresses the CRTC/CREB-mediated transcriptional program：A549转染RNA-seq（阈值|FC|>1.2, adj p<0.05）见CPS1、PDK4、LINC00473等下调；GSEA中既往定义CRTC激活集富集得分NES=?1.58（FDR q<0.001），确认优先抑制CRTC-CREB程序。

讨论总结：研究人员指出LKB1失活NSCLC缺乏有效疗法，CRTC-CREB异常激活是明确弱点；本研究将dnCRTC遗传证据转化为SAH-CBD-6药理原型，其结合CREB、破环CRTC-CREB-DNA、选择性杀伤LKB1-null细胞而不扰LKB1-WT，机制上特异阻断不依赖Ser133磷酸化的CRTC驱动通路（区别于PKA-CBP轴）。相较单靶点，同时压制协同转录网络具优势。当前肽整体转录响应尚温和，需迭代优化钉合位点、核积累及药代；可借鉴ALRN-6924、FOG-001等临床钉合肽工作流。结论译文：本研究证明靶向CRTC-CREB相互作用的钉合肽抑制剂通过选择性扰乱CRTC驱动的CREB激活，为LKB1失活NSCLC提供有前景策略；SAH-CBD既作探查CRTC-CREB生物学化学探针，亦为开发阻断该转录弱点的药理抑制剂概念验证。论文发表于《Molecular Therapy Oncology》。