鼠伤寒沙门氏菌在循环暴露于3-(二乙氨基)丙胺后产生消毒抗性

《Current Research in Microbial Sciences》：Resistance to disinfection emerges in Salmonella Typhimurium following cyclic exposure to 3-(diethylamino)propylamine

　　

研究人员对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）LT2在循环暴露于阳离子消毒剂3-(二乙氨基)丙胺（DEAPA）后产生的消毒抗性进行了研究。采用三种适应性实验室进化（ALE）方案，即递增浓度（ALE-Inc）、恒定亚抑制浓度（ALE-Con）和重复短时致死处理（ALE-Let），在受控条件下选择稳定突变。研究发现，重复致死DEAPA暴露筛选出了耐受变异体，三种ALE方案的抗性结果存在差异。获得的变异体在热处理后存活能力提升超过1000倍，两个变异体对庆大霉素的最小抑菌浓度（MIC）增加两倍。抗性表型随鉴定出的突变不同而变化。全基因组测序显示，ALE-Con变异体携带corA、folA、rfbJ、cheZ、cpxR、fliF等突变，ALE-Let变异体携带crp、adhE、cyaA、atpF等突变，涉及代谢、信号转导、转运与鞭毛运动等多类功能。结果表明，DEAPA反复暴露可在实验室条件下选择出对DEAPA与热应激均具增强耐受性的鼠伤寒沙门氏菌变异体，并伴随有限但临床相关的庆大霉素交叉抗性，提示食品工业清洗消毒（C&D）程序中胺类消毒剂的选择压力可能助长交叉耐受与交叉抗性变异体的出现。

研究背景方面，欧盟One Health 2024人畜共患病报告记录超过1000起沙门氏菌相关食源性疾病暴发，沙门氏菌病是第二常见的食源性胃肠疾病，因此控制沙门氏菌在蛋与蛋制品、混合食品及烘焙产品中的污染是重点。食品工业普遍采用清洗消毒（C&D）程序，阳离子消毒剂如季铵化合物因低反应性、表面兼容性和低毒性被广泛使用，但其生物累积与生态毒性引发关注，胺基化合物如3-(二乙氨基)丙胺（DEAPA）作为替代物受关注。DEAPA含叔氨基脂肪二胺，已被纳入部分工业消毒剂配方，但针对其抗菌用途的化合物特异性信息有限，且其在水处理氯化过程中可作为致癌N-亚硝基二乙胺前体。消毒剂选择压力可能促进抗菌素抗性出现，尽管在使用浓度下抗性报道不多，但稀释、有机物存在或表面相互作用可降低功效，在特定场景下足以利于低敏感变异体存活。适应性实验室进化（ALE）可在受控条件下通过递增浓度、恒定亚抑制浓度或重复短时致死处理选择稳定突变。生物杀菌剂抗性常非特异，涉及外排泵改变、孔蛋白通透性变化、代谢改变或细胞表面修饰等机制，且可带来对其他应激的交叉耐受或交叉抗性，如热处理的耐热性。目前虽已知部分生物杀菌剂抗性突变与抗生素抗性相关，但这些突变与C&D及食品保藏方法效能的关系不清。为此，研究人员以鼠伤寒沙门氏菌LT2为对象，用三种ALE方案评估DEAPA暴露后抗性变异体（RVs）的出现、对热与抗生素的交叉耐受/抗性，并鉴定相关遗传决定因子。

主要关键技术方法方面，研究人员使用西班牙型培养收藏中心提供的鼠伤寒沙门氏菌LT2（CECT 722）作为亲本株，设立五条平行进化谱系及无消毒剂对照。三种ALE方案分别为：ALE-Inc从0.085×MIC起始逐日约1.85倍递增DEAPA浓度至无可见生长；ALE-Con在0.7×MIC（1600 mg/L）恒定亚抑制浓度下进化30天（约300代）；ALE-Let对稳定期培养物重复10次致死处理（13000 mg/L，25 °C，15分钟）。表型鉴定包括肉汤微量稀释法测DEAPA与抗生素MIC、致死DEAPA处理测耐受性、54 °C 30分钟热处理测热交叉耐受、全基因组测序（Illumina NovaSeq，150×–350×覆盖度，BWA比对NC_003197.2，VarScan与BCFtools找SNV/indel，SnpEff注释，≥80%等位基因频率为主突变）。统计用GraphPad Prism，单因素ANOVA加Dunnett多重比较，p≤0.05为显著。

研究结果部分，3.1节显示ALE-Inc方案从191 mg/L递增至MIC（2240 mg/L）第五轮后所有谱系均无生长，未能分离出RVs。3.2节显示ALE-Con方案30天恒定1600 mg/L暴露后，五谱系中四谱系群体MIC提升15%至2560 mg/L，但单菌分离仅SeT_DC_4.2、SeT_DC_4.4、SeT_DC_5.2、SeT_DC_5.5增15%、SeT_DC_5.4增30%至2880 mg/L；选SeT_DC_4.4与SeT_DC_5.4作后续，二者对致死DEAPA处理耐受无显著提升。3.3节显示ALE-Let方案重复致死处理后所有谱系灭活对数值由约5.5 log₁₀降至1 log₁₀以下，去压再生后仅SeT_DL₃与SeT_DL₅显著耐受；分离单菌中SeT_DL_3.1、SeT_DL_3.2、SeT_DL_4.2、SeT_DL_5.1、SeT_DL_5.2显著耐受，最耐受者SeT_DL_3.2灭活约2 log₁₀；仅SeT_DL_5.1与SeT_DL_5.2的DEAPA MIC升至2880 mg/L。3.4节显示七株RVs抗生素MIC测试中，亲本氨苄西林1 mg/L、环丙沙星0.016 mg/L、庆大霉素2 mg/L；仅SeT_DL_3.1与SeT_DL_3.2庆大霉素MIC翻倍至4 mg/L，按EUCAST判为耐药，余株及氨苄西林/环丙沙星无变化。3.5节显示54 °C 30分钟热处理下亲本灭活约6 log₁₀，ALE-Con两株同亲本，ALE-Let中SeT_DL_3.1、SeT_DL_3.2、SeT_DL_5.1、SeT_DL_5.2显著耐热（SeT_DL_3.2约3 log₁₀灭活），SeT_DL_4.2不耐热。3.6节WGS显示ALE-Con两株突变分散于folA、cheZ、rfbJ、corA、STM0884、fliF、cpxR等，ALE-Let五株各含单突变：crp（HIS160PRO，SeT_DL_3.1/3.2）、adhE缺失（SeT_DL_4.2）、cyaA无义（SeT_DL_5.1）、atpF（SeT_DL_5.2）；BRITE功能分类涵盖代谢、信号转导、转运、细胞运动，表型与突变无一一对应但crp突变株兼具DEAPA耐受、耐热与庆大霉素MIC翻倍。

讨论部分总结，三种ALE方案结果迥异：ALE-Inc未得RVs可能源于菌种-化合物依赖突变率及浓度增幅；ALE-Con仅低水平MIC提升且单菌衰减，符合低浓度低水平抗性规律；ALE-Let模拟C&D短时致死接触，筛选出稳定遗传耐受株并伴热交叉耐受与庆大霉素交叉抗性。细菌持久性可解释部分谱系瞬态存活。交叉表型依赖特定突变——crp/camp-CRP（cAMP受体蛋白）全局调控关联DEAPA耐受+耐热+庆大霉素MIC增倍，cyaA失活降cAMP合成，adhE涉及应激代谢，atpF影响ATP合酶与氨基糖苷敏感性。ALE-Con多突变可能协同但贡献不明。研究限于纯DEAPA、浮游培养、实验室株，工业配方与菌群竞争下长期稳定性待考。结论部分翻译如下：据研究人员所知，本研究首次报道鼠伤寒沙门氏菌LT2可对烷基胺DEAPA产生抗性与耐受性；三种ALE方案显示抗性涌现与机制随暴露条件而异，尤其模拟消毒接触的ALE-Let方案利于涌现对DEAPA显著耐受、耐热甚至庆大霉素抗性的RVs，可能削弱食品工业C&D效能；WGS揭示适应突变高度多样且非特异，涉及全局调控、代谢、转运与鞭毛运动等，相似表型可经多分子机制达成；结果说明DEAPA反复暴露可在实验室条件下选择出对DEAPA与热更耐受的变异体，使其在可比处理下更难灭活，需在食品加工环境中进一步验证其涌现与竞争适合度以支撑食品安全风险评估。该文发表于《Current Research in Microbial Sciences》。