TRMT11–TRMT112介导的鸟苷10位甲基化优化人线粒体tRNA以实现高效翻译

《Nucleic Acids Research》：Guanosine 10 methylation by TRMT11–TRMT112 optimizes human mitochondrial tRNAs for efficient translation

　　

修饰核苷酸是RNA功能的重要决定因素，鉴定安装这些修饰的酶对于理解其细胞作用至关重要。研究人员表明，人RNA甲基转移酶TRMT11及其辅因子TRMT112通过N端靶向信号导入线粒体。利用近期开发的N2-甲基鸟苷（m2G）敏感DNAzyme，研究人员证实TRMT11的催化活性及其与TRMT112的相互作用是13种线粒体（mt-）tRNA第10位安装m2G所必需的。TRMT11在mt-tRNA上的交联谱实验支持TRMT11–TRMT112–mt-tRNATrp复合物模型：其中THUMP结构域接触受体茎的3′端，G10翻入S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合口袋进行甲基化。转录组范围定位显示TRMT11与大多数核编码和mt-tRNA相互作用，但仅甲基化子集。体外重建TRMT11–TRMT112介导的甲基化定义了不同mt-tRNA上m2G10安装的关键结构要求，并揭示致病突变如何影响该修饰。TRMT11–TRMT112识别折叠态mt-tRNA，在退化的mt-tRNALys中，m1A9强烈增强m2G10甲基化效率。缺失m2G10修饰改变众多mt-tRNA构象，扰动线粒体蛋白质合成，并损害氧化磷酸化，凸显该修饰在维持线粒体功能中的重要作用。

研究背景与立项依据

修饰核苷酸广泛存在于细胞RNA中，是微调基因表达的关键化学标记，其中转运RNA（tRNA）修饰最为丰富多样。人线粒体含22种mt-tRNA，因结构退化需依赖修饰维持折叠与解码能力。N²-甲基鸟苷（m²G）在生命三域tRNA中保守存在，线粒体中定位于第10位（m²G10），与第25位C配对启动D臂形成，但此前负责线粒体m²G10安装的甲基转移酶（MTase）一直未明。已知胞质核tRNA的m²G10由THUMP结构域蛋白TRMT11与辅因子TRMT112完成，TRMT1只靶向G26，因此研究人员推测TRMT11可能兼具线粒体定位与mt-tRNA修饰功能。该研究发表于《Nucleic Acids Research》，旨在鉴定线粒体m²G10甲基化酶、解析底物识别机制并评估其生理意义。

主要技术方法概览

研究人员以人HCT116细胞及HEK293 Flp-In T-REx细胞为材料，构建TRMT11及TRMT112稳定表达与基因敲除（TRMT11^KO）体系；通过蛋白酶保护实验与双分子荧光互补（BiFC）定位亚细胞分布；利用UV交联cDNA分析（CRAC）绘制全转录组tRNA互作图谱；开发m²G敏感DNAzyme切割 assay 定性检测m²G10；结合LC-HRMS定量核苷、体外重组TRMT11–TRMT112甲基化反应（³H-SAM掺入）、MTR1核酶预装m¹A9、AlphaFold3建模与ISOLDE局部精炼解析复合物构象；最后用蔗糖密度梯度、体外线粒体翻译（in organello）、Seahorse XF应激测试评估翻译与呼吸表型。

研究结果

TRMT11和TRMT112定位于线粒体基质

蛋白酶保护实验显示TRMT11-His-FLAG在完整线粒体与线粒体体（mitoplast）中均抗Proteinase K消化，与基质蛋白mL44行为一致；BiFC中COX8A靶向Venus-N与TRMT11-Venus-C在线粒体共定位。碳酸钠抽提表明TRMT11为外周膜关联基质蛋白。MitoFates预测N端2–67（TRMT11）与2–23（TRMT112）为弱置信线粒体靶向序列（MTS）；删除相应片段（TRMT11_Δ2–67、TRMT112_Δ2–23）后线粒体导入丧失，确认N端信号介导双蛋白线粒体导入。

TRMT11交联至胞质与线粒体tRNA

CRAC测序显示TRMT11-His-FLAG显著富集于核tRNA与全部13种mt-tRNA，峰值集中在D臂G10周边及受体茎，提示其广结合但选择性催化。对照His-FLAG无此富集。

TRMT11–TRMT112催化mt-tRNA m²G10安装

DNAzyme assay中HCT116野生型总小RNA可被mt-tRNA^Trp DNAzyme切割，TRMT11^KO细胞及TRMT112 RNAi细胞中切割信号消失；回补WT TRMT11而非催化死突变体TRMT11_D244A恢复切割。LC-HRMS定量显示TRMT11^KO线粒体m²G峰消失。体外用重组TRMT11–TRMT112与³H-SAM对IVT mt-tRNA甲基化，仅折叠态底物掺入显著，线性tRNA前体无反应；mt-tRNA^Lys若经MTR1核酶预装m¹A9，甲基化速率明显提升，证明m¹A9为正调控元件。

TRMT11–mt-tRNA复合物结构模型

AlphaFold3预测TRMT11–TRMT112–mt-tRNA^Trp三元模型（ipTM 0.85），DiffDock-L嵌入SAM，ISOLDE手动翻转G10入袋。模型中THUMP域抓握受体茎3′端，G10碱基翻出朝向SAM甲基碳，S–C–N攻击角符合S_N2样转移几何，与已知TRMT112家族活性中心一致。

m²G10缺失扰动mt-tRNA构象与线粒体功能

非变性PAGE与Northern显示TRMT11^KO细胞中多种mt-tRNA迁移异常，氨基酸接受（aminoacylation）效率未变但核糖体结合分数下降（蔗糖梯度）。In organello翻译中³⁵S-Met掺入降低；Seahorse显示基础与最大耗氧率（OCR）下降，胞外酸化率（ECAR）代偿上升，氧化磷酸化复合体蛋白量略减。表明m²G10通过稳定tRNA三级折叠保障翻译延伸。

讨论与结论翻译

研究人员在讨论中指出，TRMT11–TRMT112是首个人线粒体m²G10甲基化酶复合体，其双定位（胞质/线粒体）延续了TRMT112作为修饰hub的特性。m²G10虽不改变Watson–Crick配对，但增强堆叠并固定D臂铰链，对退化mt-tRNA尤为关键；m¹A9的存在可局部解稳A9–U21对从而暴露G10，解释mt-tRNA^Lys的高效修饰。缺失m²G10导致翻译保真度与产率下降，最终损害氧化磷酸化，为线粒体病致病机制提供新修饰层面解释。结论为：TRMT11–TRMT112通过N端靶向序列进入线粒体，识别折叠态mt-tRNA并在G10安装m²G，该修饰优化mt-tRNA构象、维持线粒体蛋白质合成与能量代谢，是线粒体tRNA修饰网络不可或缺的一环。