从手工山羊奶酪中分离的三株微生物的草图基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genomic sequence of lactic acid bacteria: Lactiplantibacillus plantarum LP48, Enterococcus durans ED01, and Bacillus subtilis BS01 with biotechnological potential

　　

摘要

我们报告了从手工山羊奶酪中分离的植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum LP48、耐酸乳球菌Enterococcus durans ED01和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BS01的草图基因组序列。菌株通过PCR、Sanger测序和Illumina全基因组测序进行了鉴定。组装结果显示了菌株特异性特征。

公告

乳酸菌（LAB）是革兰氏阳性微生物，由于其代谢多样性（1）、抗菌活性和公认安全性（GRAS）状态（2），被广泛用于手工和工业食品发酵。除了技术意义外，许多LAB菌株还表现出益生菌和促进健康的特性以及抗菌活性，使得基因组测序成为表征其功能和生物技术潜力的必要方法（3–5）。本文报告了从手工山羊奶酪中分离的植物乳杆菌Lactiplantibacillus plantarum LP48、耐酸乳球菌Enterococcus durans ED01和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BS01的草图基因组序列。

奶酪样品来自西班牙的手工山羊奶生产系统，包括埃斯特雷马杜拉和纳瓦拉地区，按照之前描述的方法进行处理（6）。样品（10克）在蛋白胨水中匀浆，系列稀释，接种于De Man、Rogosa和Sharpe琼脂（MRS），并在37°C厌氧培养48小时或在30°C好氧培养72小时。具有圆形、光滑、白色至奶油色形态的疑似LAB菌落被纯化，在MRS肉汤中传代培养，并通过过氧化氢酶测试、革兰氏染色和细胞形态进行表征。

LAB在上述培养条件下激活。使用Wizard Genomic DNA纯化试剂盒（针对革兰氏阳性细菌，Promega）提取基因组DNA。通过使用引物16SFw（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和16SRv（5′-GAAAGGAGGTGATCCAGCCG-3′）对16S核糖体RNA（rRNA）基因进行PCR扩增和Sanger测序来进行物种鉴定。扩增子被纯化，双向测序，使用DNAstar MegAlign组装，并通过BLAST与GenBank进行比较（登录号：L. plantarum：NR_117813.1，Leuconostoc mesenteroides：NR_074057.1，Lactococcus lactis Hordniae：NR_040956.1）。分离物最初被鉴定为植物乳杆菌L. plantarum、肠膜明串珠菌L. mesenteroides和乳糖乳球菌霍迪亚亚种L. lactis subsp. Hordniae（6）；后两者在经过美国国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank质量控制和平均核苷酸同一性（ANI）测试后，分别被重新鉴定为耐酸乳球菌Enterococcus durans和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

全基因组测序由英国的MicrobesNG通过GetGenome倡议进行。菌株在MRS培养基上培养（用于L. plantarum）和在M17培养基上培养（用于E. durans和B. subtilis）。使用DNeasy血液和组织试剂盒（Promega，美国）提取基因组DNA，DNA质量由MicrobesNG内部使用Qubit评估。测序文库使用Nextera XT文库制备试剂盒（Illumina）制备，使用双份DNA输入和45秒的PCR延伸时间。在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序（250 bp），产生约30倍基因组覆盖度。

原始测序读段使用FastQC v0.12.1在Galaxy平台上进行质量评估，如参考文献7所述，使用Trimmomatic v0.30进行修剪，使用滑动窗口质量截断值Q15（8）。从这个分析中，我们获得了LP48的两套原始读段（1,056,622个序列；260.5 Mbp）、ED01原始读段（651,019个序列；160.3 Mbp）和BS01原始读段（824,208个序列；203.2 Mbp）。使用SPAdes v3.7进行从头基因组组装（9），使用Prokka v1.11进行基因组注释（8）。除另有说明外，使用默认参数。使用Quast v5.3.0+galaxy1确定组装质量（10）。这些数据组在DOI https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33029324下上传至Figshare。序列读段档案（SRA）和组装结果均提交至NCBI GenBank，生物项目代码为PRJNA1354809。在GenBank质量控制和ANI测试后，样品被重新鉴定为耐酸乳球菌E. durans ED01和枯草芽孢杆菌B. subtilis BS01。样品使用NCBI原核生物基因组注释管道（PGAP）修订版6.10进行了重新注释。LAB的草图基因组在表1中详细说明。

表1

表1 从手工山羊奶酪中分离的LAB菌株的基因组组装统计数据，数据来自NCBI PGAP注释

菌株	LP48	BS01	ED01
物种	Lactiplantibacillus plantarum	Bacillus subtilis	Enterococcus durans
基因组大小（Mb）	3.4	4.2	2.9
GC含量（%）	44.5	43.5	38
连续序列数量	33	107	111
最大连续序列	816,388	251,640	297,967
支架N50（Kb）	565.3	101.7	77.3
支架L50	3	13	12
编码序列（总数）	3,145	4,415	2,794
rRNA	1, 1（16S, 23S）	3, 3, 4（5S, 16S, 23S）	1, 2, 2（5S, 16S, 23S）
tRNA	65	73	55
覆盖度	~30×	~30×	~30×
组装代码	ASM5652238v1	ASM5662936v1	ASM5662935v1
SRA代码	SRS26946111	SRS26946112	SRX30950808
BioSample	SAMN52956092	SAMN52956093	SAMN52956094

这些草图基因组序列扩展了从手工乳制品中分离的LAB的可用基因组资源，并为未来研究其技术性和功能性特征提供了基础。

致谢

本研究最初于2018年在西班牙科尔多瓦大学由ERASMUS+博士奖学金资助启动，由Luis M. Medina Canalejo指导，题为：乳杆菌属乳制品来源的分离与表征。完整的测序工作由GGLatAm2024项目、Getgenome资助，用于将非致病性和可培养乳酸菌株的细菌基因组测序运送和确定至英国。