荧光快速现场评估（F-ROSE）实时视觉检测与13C-尿素呼气试验在检测幽门螺杆菌上的临床对比研究

《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Clinical Comparative Study of Fluorescence Rapid On-Site Evaluation (F-ROSE) Real-Time Visual Detection versus 13C-Urea Breath Test for Helicobacter pylori

　　摘要
背景
13C-尿素呼气试验（13C-UBT）被广泛用于检测幽门螺杆菌（H.pylori），但其存在一些局限性，包括无法区分活菌和死菌、诊断灰区范围不明确（DOB 4-10），以及在细菌负荷较低时可能出现假阴性结果。

目的
比较荧光快速现场评估（F-ROSE）和13C-UBT在检测幽门螺杆菌感染方面的诊断价值，确定13C-UBT阳性所需的临界活菌计数阈值，明确13C-UBT灰区内的真实感染状态，并揭示DOB值与活菌计数之间的定量关系。

方法
共纳入180名接受胃镜检查的患者，同时进行F-ROSE定量检测和13C-UBT。F-ROSE使用吖啶橙-溴化乙锭（AO-EB）双荧光染色方法，在×400高倍视野（HPF）下计数总细菌数、活菌数和死菌数。13C-UBT的结果通过DOB值确定。结合贝叶斯模型的潜在类别分析（LCA）用于推断真实感染状态。接收者操作特征（ROC）曲线用于确定13C-UBT阳性的临界活菌计数阈值，并评估其诊断效能。

结果
在180名患者中，模型推断出94例真阳性和86例真阴性病例。F-ROSE的阳性率为51.1%，显著高于13C-UBT的47.2%（P<0.05）。以真实感染为参考：F-ROSE的敏感性为93.6%，特异性为94.2%，AUC为0.954；13C-UBT的敏感性为80.9%，特异性为93.0%，AUC为0.878。ROC分析表明，活菌计数≥10/HPF是13C-UBT的稳定阳性阈值（P<0.001）。

结论
13C-UBT的阳性结果取决于活菌计数阈值≥10/HPF。细菌负荷较低的感染容易归类为灰区或被漏诊。临床灰区大多代表真正的活菌感染，传统的“先观察”策略存在偏差。F-ROSE能够实时可视化活菌并准确量化细菌数量，突破了13C-UBT的阈值限制，使其成为检测细菌负荷低和处于临床灰区的幽门螺杆菌感染的最佳技术。

引言
幽门螺杆菌（H. pylori）是一种革兰氏阴性微需氧杆菌，定植于人体胃黏膜，与慢性胃炎、消化性溃疡病、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌密切相关[1, 2]。世界卫生组织将其列为I类致癌物[3, 4]，全球超过一半的人口感染了幽门螺杆菌，发展中国家的发病率更高[5, 6]。据最新估计，中国大陆约有5.89亿人感染了幽门螺杆菌，患病率为42.3%，属于全球“高发病率”地区[7]。全球患病率因地区而异。中亚（包括蒙古和乌兹别克斯坦）、非洲、中东及拉丁美洲（如墨西哥）的成人感染率最高（≥60%）。中国、东欧和俄罗斯的感染率处于30-60%的中等范围，高于欧洲的平均水平32.7%。在儿童中，印度的感染率最高（≥75%），其次是巴基斯坦、许多非洲国家和部分中亚及拉丁美洲国家（45-75%）。按世卫组织区域划分，非洲的成人感染率最高（53.8%），其次是东地中海地区（51.7%）和美洲地区（48.6%），欧洲最低（32.7%），儿童的情况也类似[8, 9]。在中国，农村地区的感染率明显高于城市地区，主要传播途径是家庭聚集性感染。第六次全国幽门螺杆菌感染管理共识报告指出，“幽门螺杆菌感染是胃癌最重要的可控制风险因素”[10]。因此，早期准确检测幽门螺杆菌感染并及时进行根除治疗对于降低胃癌疾病负担至关重要[11-16]。

目前的幽门螺杆菌检测方法分为侵入性和非侵入性两种[17]。最常用的非侵入性检测方法是13C-尿素呼气试验（13C-UBT），因其非侵入性、便捷性和相对较高的特异性而被广泛应用于筛查和随访。然而，该方法只能检测尿素酶活性，无法区分活菌和死菌、观察细菌形态或量化实际细菌负荷，这在诊断灰区（DOB 4-10）尤其会造成临床不确定性，导致临床医生常采取“随访不进行根除”的策略[18, 19]。此外，在细菌负荷低、分布不均或细菌活性受抑制的情况下，13C-UBT容易出现假阴性结果。因此，13C-UBT阳性所需的活菌计数阈值以及灰区内感染的生物学特性仍不明确。

以往尝试将UBT值与细菌负荷相关联的研究依赖于组织学、培养、RUT或PCR作为参考标准，但这些方法在评估活菌负荷方面存在根本性局限性。组织病理学无法区分活菌和死菌；培养虽然是检测活菌的黄金标准，但技术要求高且速度慢，难以用于临床验证；PCR检测的是DNA而非活菌状态；RUT检测的是尿素酶活性，需要≥10?个细菌才能获得可靠结果。其他非侵入性检测方法如粪便抗原检测（SAT）和粪便PCR已用于儿童和大规模筛查[17, 20]。SAT操作简单且根除前敏感性高，但无法区分活菌和死菌抗原，在细菌负荷低时可能产生假阴性结果。粪便PCR虽然可通过23S rRNA、16S rRNA和glmM等目标同时检测感染和克拉霉素耐药性，但也只能检测DNA，无法区分活菌状态，可能因粪便中的PCR抑制剂而产生假阳性[20, 21]。关键在于，这些方法都无法同时可视化细菌形态、实时量化活菌负荷并提供即时检测结果。

荧光快速现场评估（F-ROSE）是一种基于传统ROSE方法的新兴辅助技术[22-24]。ROSE已被广泛认为是细胞病理学中的临床有用工具[25]。基于荧光的ROSE在肺部和传染病诊断中已被验证为有效的补充诊断手段[26, 27]。在胃肠道病理学中，荧光原位杂交（FISH）已成为检测活检标本中惠普尔病和耐大环内酯类抗生素的幽门螺杆菌的辅助诊断方法[28, 29]，而免疫荧光染色在胃黏膜活检中的幽门螺杆菌检测率与传统的13C-UBT相当，优于HE染色和细菌培养[30, 31]。F-ROSE利用吖啶橙-溴化乙锭（AO-EB）双荧光染色，在内镜检查期间直接对新鲜胃黏膜活检组织进行标本制备、染色和解读，15-25分钟内完成活菌（黄绿色荧光）和死菌（橙红色荧光）的区分，实现对幽门螺杆菌的定性、定量和活菌状态的同时评估。因此，F-ROSE首次实现了活菌负荷的直接量化及其与UBT DOB值的关联，填补了相关知识空白。本研究旨在确定UBT阳性的活菌阈值，并明确UBT灰区的临床意义。尽管如此，F-ROSE仍需进一步进行临床验证，其诊断性能需与现有的非侵入性参考标准进行系统评估。

组织学、培养、PCR、快速尿素酶检测和复合参考标准在幽门螺杆菌诊断中均存在不足，如采样误差、灵敏度有限、无法区分活菌及引入偏差等。本研究采用贝叶斯潜在类别分析（LCA）推断真实感染状态，同时评估检测准确性并考虑条件依赖性[32-36]，比较了F-ROSE和13C-UBT的结果，明确了13C-UBT阳性的活菌阈值，并分析了灰区内的细菌负荷。

伦理批准
本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，获得了中国人民解放军总医院伦理委员会的批准（编号S-2026-003-01），并在中国临床试验注册中心（ChiCTR2600125137）注册。所有参与者在参与研究前均签署了书面知情同意书。

研究参与者
共纳入180名在本院（中国人民解放军总医院第八医学中心）接受常规胃镜检查的患者。

潜在真实感染状态和阳性率比较
贝叶斯LCA在180名参与者中识别出94例真阳性和86例真阴性病例，潜在感染率为52.2%。双类模型的拟合度优于单类模型，AIC（371.24 vs 501.98）、BIC（387.20 vs 508.36）和样本量调整后的BIC（371.37 vs 502.03）更低。双类模型的熵为0.89， infected类别的后验概率平均为0.94，非感染类别的后验概率平均为0.93。

讨论
据我们所知，本研究首次从活菌计数阈值的角度揭示了13C-UBT的检测模式和局限性，阐明了F-ROSE的核心优势，并为纠正传统认知偏差和优化诊断策略提供了关键证据。

结论
在本研究人群中，13C-UBT检测幽门螺杆菌的结果依赖于活菌计数阈值：当活菌计数≥10/HPF时，可获得稳定的阳性结果；低于此阈值时，病例容易归类为灰区或出现假阴性结果。13C-UBT临床灰区（DOB 4-10）内的真实感染率高达75.0%，这些病例均为细菌负荷较低的活菌感染（4-9/HPF）。

伦理声明
所有参与者或其法定代理人已签署书面知情同意书，同意参与本研究并发表论文。尊重参与者的隐私权。本研究使用了人体生物样本，采集样本时已获得捐赠者或其亲属或法定代理人的同意。

作者贡献声明
刘俊宇：撰写——原始草稿、可视化、方法学、数据分析；
张琳：撰写——修订与编辑、监督、方法学、资金筹集、数据分析；
侯艳红：数据分析；
李冰辉：数据分析；
吴凯：数据分析；
张静：数据分析；
杨咪：数据分析。