《Engineering Microbiology》：Menaquinone biosynthesis in
Lactococcus lactis: recent advances and future prospects
微生物生产甲萘醌（MKs）已引起越来越多的关注。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是细菌中生产MK的优良底盘菌株。目前正在开发提高L. lactis中MK生物合成的方法。重组工程（recombineering）是提高L. lactis中MK滴度的有前景的工具。来源于大肠杆菌（E. coli）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的MK生产见解被用于指导L. lactis的研究。
1. 引言
维生素K（VK）是人体必需的脂溶性维生素，包含一组以2-甲基-1,4-萘醌环为基本头部的密切相关衍生物。VK主要分为两类：VK1（叶绿醌）和VK2（甲萘醌，MKs）。VK1以叶绿基侧链为特征，广泛存在于绿叶蔬菜和植物油中，是VK的主要膳食来源。相比之下，VK2含有多聚异戊二烯侧链，并根据侧链中异戊二烯残基数（n）进一步分为短链MKs（n≤4）和长链MKs（n=5–13）。短链MKs可在人类和动物组织中内源合成，并富含于肉类、蛋类和乳制品中。而长链MKs仅由细菌产生，由于比短链MKs更具疏水性，被认为具有更长的半衰期和更好的生物利用度。
作为γ-谷氨酰羧化酶的关键辅因子，VK2在血液凝固和骨代谢调节中发挥关键作用，并能有效缓解血管钙化。骨钙素被γ-谷氨酰羧化酶羧化后，才能结合钙离子。若VK2不足，骨钙素无法被激活，钙不能有效沉积于骨骼，增加骨质疏松风险。临床研究证实，膳食VK2摄入量与冠状动脉钙化呈负相关，高摄入组个体钙化程度较低。每日至少摄入32.7 μg VK2可使冠心病（CHD）发病率降低41%；每日额外增加10 μg VK2摄入可使CHD风险进一步降低9%。VK2可通过纳豆、奶酪等发酵食品补充。日本率先开发和应用VK2，这一突破与富含VK2的纳豆密切相关，纳豆中VK2含量约为0.7–1.0 mg/100 g。然而，纳豆因其风味而不易被广泛接受。目前，膳食VK2摄入不足是全球性问题，即使在乳制品消费量较高的西欧国家，膳食VK2摄入量也仅占所需总维生素K的10%至25%。因此，开发具有增强VK2生物合成能力的食品发酵剂具有重要现实意义。
MK是细菌细胞膜的重要组分，在氧化磷酸化、呼吸系统电子传递和细胞主动转运中发挥关键作用。多种细菌可生产MK，主要分布于芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、拟杆菌属（Bacteroides）、乳球菌属（Lactococcus）和明串珠菌属（Leuconostoc）物种。长链MK的生物合成途径已以枯草芽孢杆菌为模型进行了深入研究；通过代谢工程改造，B. subtilis可实现MK-7产量高达415 mg/L。目前，B. subtilis因其公认安全（GRAS）地位、食品安全性、完善的基因工程工具以及成熟的发酵和下游提取工艺，被广泛用作维生素K2（MK-7）生产的微生物细胞工厂。然而，作为富含VK2的B. subtilis发酵食品载体，纳豆受众相对有限。另一种VK2微生物细胞工厂是大肠杆菌（E. coli），其遗传背景完全清晰，培养调控系统成熟；但E. coli存在残留脂多糖内毒素的风险，阻碍其在食品相关制造中的应用。主要乳制品发酵剂乳酸乳球菌（L. lactis）是众所周知的长链MK天然生产者，特别是MK-8、MK-9和MK-10。然而，L. lactis的长链MK产量低于B. subtilis，半硬质奶酪中天然存在的MK-9和MK-8中位含量分别约为149 μg/100 g和55 μg/100 g。表1比较了三种可能的VK底盘类型。随着对L. lactis生理功能的深入研究和遗传操作工具的改进，开发具有更高VK2产量的L. lactis菌株日益受到关注，使L. lactis有望成为VK2底盘。本综述首先阐述L. lactis的核心代谢特征，然后系统剖析MK在L. lactis中的生物合成途径和生理作用，以及提高长链MK产量的L. lactis菌株选育。同时整合其他微生物底盘（如E. coli和B. subtilis）中开发的高产VK2策略，为合理代谢工程改造L. lactis以进一步提高VK2产量提供理论框架和技术见解。
2. L. lactis的碳代谢特征
L. lactis是奶酪生产中使用最广泛的发酵剂菌株。比较基因组分析表明，该商业发酵剂起源于非乳品生态位，并通过还原性进化过程在乳环境中被驯化。在还原性进化驱动下，L. lactis发生了针对性的代谢适应，以快速发酵乳糖和分解酪蛋白。乳源L. lactis与植物源菌株相比利用的碳源种类较少，主要是乳糖和葡萄糖，以及半乳糖和果糖。乳糖通过磷酸转移酶系统高效转运进入L. lactis细胞，并迅速水解为葡萄糖和半乳糖-6-磷酸。葡萄糖是首选且利用最快的碳源，直接进入恩登-迈耶霍夫-帕尔纳斯（EMP）途径，而半乳糖-6-磷酸则通过Leloir或塔格糖-6-磷酸途径进入糖酵解。在多种碳源存在时，L. lactis通常优先利用葡萄糖，仅在葡萄糖耗尽后才开始代谢替代底物，这一过程受碳分解代谢物阻遏机制调控。
2.1. 同型乳酸发酵
在静置条件下，L. lactis的糖酵解碳流高度定向，超过90%的丙酮酸通量最终生成乳酸，形成同型乳酸发酵。细胞仅通过底物水平磷酸化获得有限能量，胞内氧化还原平衡由乳酸脱氢酶维持，该酶消耗糖酵解过程中产生的NADH。
2.2. 混合酸发酵
在葡萄糖限制的恒化培养或低生长速率条件下，丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）被激活，产生甲酸、乙醇和乙酸，细菌进行混合酸发酵。在好氧条件下，PFL失活，而丙酮酸脱氢酶复合物被激活。丙酮酸经丙酮酸脱氢酶复合物转化为乙酰辅酶A。因此，乳酸产量降低，而乙酸产量显著增加，菌株仍进行混合酸发酵。过量丙酮酸还可转化为双乙酰和乙偶姻。在乙酸生产过程中，乙酰辅酶A先在好氧条件下由磷酸转乙酰酶转化为乙酰磷酸，再经乙酸激酶催化进一步转化为乙酸，同时产生ATP。
2.3. 好氧呼吸
外源补充血红素时，L. lactis通过混合酸发酵启动好氧呼吸。这种代谢转换依赖三个核心组分：NADH脱氢酶（由noxA和noxB编码）、MK（由menA基因和menFDXBEC基因簇编码）以及细胞色素bd氧化酶（由cydABCD基因簇编码）。简言之，糖酵解产生的NADH作为电子供体，被NADH脱氢酶氧化为NAD?。电子随后通过MK传递给细胞色素bd氧化酶，最终与氧结合生成水，同时通过F?F?-ATP合酶高效产生ATP；该过程比发酵代谢高效得多。在此过程中，NADH脱氢酶与乳酸脱氢酶竞争NADH，导致乳酸产量显著下降，乙酸生成增加，环境酸化速度减慢。因此，碳源被更高效地利用，生物量大幅增加。与某些需要外源MK的乳杆菌属物种不同，L. lactis拥有完整的MK生物合成途径。作为电子传递链中的关键中间载体，MK使高效电子传递成为可能。其生物合成能力是该菌进行好氧呼吸的先决条件，也是其相较于其他乳酸菌的主要代谢优势。
3. L. lactis中的MK生物合成
3.1. MK合成途径
作为呼吸链中必需的电子传递载体，MK在L. lactis中由三个代谢模块合成，包括1,4-二羟基萘甲酸（DHNA）合成、异戊二烯侧链合成以及二者的聚合和甲基化。
对于DHNA的形成，中间代谢物磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸用于合成莽草酸，莽草酸进一步转化为分支酸，作为DHNA醌骨架的起始底物，由MenF、MenD、MenX、MenC、MenE、MenB和MenI组成的七酶途径催化。首先，分支酸经异分支酸合酶MenF转化为异分支酸，然后在SEPHCHC合酶MenD催化下转化为2-琥珀酰-5-烯醇丙酮酰-6-羟基-3-环己烯-1-羧酸（SEPHCHC），这是DHNA的关键中间体。MenE催化的反应消耗ATP，完成核心环结构的构建。近期报道发现MenF和MenD负责调控DHNA生物合成，其中MenD在控制DHNA浓度方面发挥更突出的作用。
异戊二烯侧链合成始于乙酰辅酶A，通过甲羟戊酸（MVA）途径进行。乙酰辅酶A经缩合和还原消耗NADPH生成甲羟戊酸。MVA随后转化为异戊烯基二磷酸（IPP，C5）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP，C5）。两分子IPP与一分子DMAPP在香叶基香叶基二磷酸合酶（IspA）催化下缩合为法尼基二磷酸（FPP，C15）。通过进一步向FPP添加IPP单元，可形成不同长度的多聚异戊二烯二磷酸链。例如，一分子FPP与四分子IPP缩合生成庚异戊二烯二磷酸（HPP，C35）；该过程由庚异戊二烯二磷酸合酶催化，在B. subtilis中由hepT/hepS编码。B?e（2020）报道，L. lactis中一种潜在的多聚异戊二烯二磷酸合酶可利用五分子IPP和一分子FPP产生壬异戊二烯焦磷酸（NPP，C45）；但该功能仍需进一步的生化证据验证。
多聚异戊二烯二磷酸链通过DHNA多聚异戊二烯转移酶MenA连接至DHNA的C3位，形成脱甲基甲萘醌（DMK），再经甲基转移酶MenG进一步甲基化。多聚异戊二烯二磷酸链的长度决定所产生MK的类型。当DHNA与IPP结合时产生MK-1，与FPP结合时产生MK-3；与HPP或NPP结合时分别产生MK-7或MK-9。
3.2. MK在L. lactis中的生理功能
作为革兰氏阳性菌中的电子载体，MK参与有氧呼吸和无氧呼吸，是维持细菌能量代谢、氧化还原平衡和生存适应性的关键分子。MK驱动胞外电子传递（EET）以支持无氧呼吸，并通过还原反应产生活性氧（ROS）。同时，MK是有氧呼吸链的关键因子，增强ATP合成并优化代谢产物生成。鉴于MK在细菌呼吸中的不可或缺作用，MK生物合成途径是开发抗菌药物的新靶点。在L. lactis中，MK的功能高度依赖链长和环境，在有氧和厌氧条件下表现出不同的功能分化。
MK-1由一个DHNA单元和一个IPP单元组成。仅产生MK-1的L. lactis突变株在厌氧条件下对偶氮染料和Cu2?具有更高的还原效率，表明MK-1在EET中具有优越性能。侧链含三个IPP单元的MK-3表现出与MK-1相似的功能。研究表明，MK-3主要在生长后期合成，其产生受碳分解代谢物蛋白CcpA直接调控。与长链甲萘醌相比，短链甲萘醌（如MK-3）在厌氧条件下表现出更高的EET效率，包括Cu2?还原。通过以MK-1或MK-3作为电子载体支持厌氧呼吸，可增强稳定期的细胞活力，因为产生了额外能量。在缺乏血红素的有氧培养条件下，呼吸链无法激活，L. lactis合成的MK介导氧还原并产生ROS。其中，内源性甲萘醌，特别是短链形式如MK-3和脱甲基-MK-3，可与氧进行氧化还原循环，促进ROS形成。氧化应激被氧化还原活性金属（如铜和铁）进一步加剧，这些金属催化高活性羟基自由基的产生。因此，产生短链MK的野生型菌株在金属诱导的氧化应激下生长受损，而缺乏内源MK合成的menB缺陷突变株则表现出增强的耐受性。此外，L. lactis产生的短链MK可交叉喂养机会致病菌无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），激活其呼吸并刺激其生长。在有氧呼吸条件下，长链MK（MK-8/9）和MK-3负责L. lactis中的电子传递；MK-8/9是电子传递链的核心成员，带来更高的生物量产量、更高的耗氧速率和更长的细胞存活时间。有观点认为，短链和长链MK之间的疏水性差异是不同电子传递途径的主要决定因素。更疏水的长链MK嵌入脂质膜，可能参与有氧呼吸。相比之下，疏水性较低的短链MK在EET中发挥更大作用，甚至充当可溶性电子穿梭体。
3.3. L. lactis中MK谱和产量的调控
如上所述，不同链长的MK同系物在生物利用度和生理功能上存在差异。不同L. lactis菌株中已报道了多种MK类型和水平。L. lactis可产生MK-1、MK-3等短链MK以及MK-5至MK-10等长链MK，其中MK-8、MK-9和MK-10是最丰富的形式。根据现有报道，MK谱和总产量均可通过优化培养条件或菌株开发同时调控。
3.3.1. 培养条件优化
培养条件优化是同步调控MK谱和产量的基本方法。据Liu等报道，L. lactis subsp. cremoris MG1363的MK生物合成受培养条件显著调节，同时改变总产量和MK类型。在温度方面，MG1363在30 °C和33.5 °C时总VK2滴度和单位细胞产量最高，约为37 °C时的两倍。随着温度从20 °C升至37 °C，MK-9的相对丰度从80%逐渐降至50%，而MK-5至MK-8的比例相应增加。碳源也影响MK产量和分布；以甘露醇或半乳糖为碳源时，MK-9相对丰度约为60%；以果糖、葡萄糖、海藻糖和麦芽糖为碳源时约为65%。值得注意的是，以甘露醇为碳源时总VK2滴度达到葡萄糖时的2.4倍。有观点认为，碳源可能通过不同的碳代谢途径影响分支酸的供应，从而改变MK产量。相比之下，通气和能量代谢模式产生更显著的调节效应；通气显著富集长链MK的产生并大幅提高总VK2产量，而静置培养有利于积累相对较短链的MK。添加血红素的好氧呼吸进一步增强长链MK生物合成，显著提高MK-8和MK-9的比例，而静置发酵导致MK-9比例较低、中短链同系物水平较高。与静置培养相比，好氧发酵和好氧呼吸均显著提高了VK2滴度和单位细胞产量。生长后期低氧分压触发MK快速积累，伴随短链MK比例回升，从而可通过调整培养周期实现产量和谱型的协同优化。由于MK生物合成是耗能过程，好氧发酵或好氧呼吸期间MK产量的增加与这两种条件下产生的更多能量密切相关。
3.3.2. 菌株开发
菌株开发是同时提高MK产量和定向重塑其谱型的关键策略，可通过自然方式或人工方式实现。基因工程是提高L. lactis中MK产量的可行策略。过表达menF和menA促进MK-3产生，而过表达mvk和llmg_0196增强MK-9形成。根据MK生物合成途径，menF的过表达有助于提高DHNA的生产能力，而更多的MenA则会通过连接异戊二烯侧链增加DHNA的异戊二烯化。由于长侧链无法及时产生，过表达menF和menA可获得更多短链MK（如MK-3）。过表达mvk和llmg_0196增加了长侧链的供应，导致MK-9产量增加。Li等通过调节menF与menD的表达比例精确控制MK头部结构DHNA的生物合成，并利用合成生物学优化底物供应，在保持稳定产量的同时避免细胞毒性。敲除menF完全阻断MK生物合成途径，而异源互补来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri）的menA、menB、menG等基因可恢复有氧呼吸和MK生物合成。考虑到基因修饰生物在食品加工中的实际应用仍受限制，实验室进化提供了另一种可行的育种方法以获得MK产量提高的突变菌株。Liu等通过在好氧条件下进行100轮传代培养和筛选获得一株进化菌株，其长链MK产量较亲本菌株提高50%–110%，且MK谱无明显改变。进化菌株的基因组测序揭示了ldh和gapB中的突变，但潜在机制尚不清楚。此外，不同L. lactis菌株之间存在MK谱和滴度的自然差异。例如，Morishita等报道L. lactis菌株YIT 2011是主要的MK-8和MK-9生产者，在发酵乳中分别提供71和113 nmol/L的MK-8和MK-9，为不同MK的协同生产提供了天然菌株资源。
3.3.3. L. lactis中MK生产的主要瓶颈
尽管培养条件优化和菌株开发提高了L. lactis中的MK产量，但仍存在一些固有瓶颈阻碍进一步增产。前体供应可被视为主要限制因素。DHNA生物合成由磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸启动，经莽草酸途径生成分支酸，并经过由MenF、MenD、MenX、MenC、MenE、MenB和MenI催化的七个连续酶促反应产生DHNA。L. lactis中DHNA的生物合成受可逆通量、别构反馈抑制、底物限制和基因空间排布之间的相互作用调控。静态的单基因过表达仅能实现DHNA通量的边际增强，无法动态满足前体需求。此外，不受控制的DHNA积累可能通过扰乱醌介导的氧化还原平衡而产生代谢应激，从而限制细胞对增强VK2生物合成的耐受性。因此，L. lactis中现有调控策略无法平衡前体供应和细胞毒性，成为MK生物合成的主要制约因素。相比之下，异戊烯基二磷酸是合成十一异戊二烯焦磷酸的构建模块，后者是肽聚糖合成的必需底物。因此，过量IPP分流至MK侧链会影响细胞正常生长。
MK生物合成还面临膜负载能力饱和和胞内产物毒性的叠加限制。作为一种高度亲脂的脂醌，MK优先分配至细菌磷脂双分子层。然而，膜嵌入能力固有有限，过量MK积累可能破坏膜组织和细胞稳态。与许多水溶性代谢物不同，MK是疏水性膜相关醌，主要积累于细菌膜内。尽管L. lactis基因组已充分表征，但尚未通过实验鉴定出专门的MK输出系统，使得胞内膜积累成为合成MK的主要命运。MK生物合成中间体DHNA的积累通过抑制上游酶MenD介导MK途径的反馈调控。
胞内NADPH短缺也限制MK合成效率。MK生物合成级联中的多个还原步骤高度依赖NADPH作为氢化物供体。然而，L. lactis中糖酵解代谢占主导，主要产生NADH而非NADPH，磷酸戊糖途径通量极低。内源NADPH再生速率无法维持长链MK同系物（MK-8/MK-9）的高效合成。目前研究仅通过过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶确认可提高胞内NADPH池，但尚未开发出专门用于补充MK生产还原力的稳定动态调控回路。这导致长链MK生物合成所需的还原当量持续缺乏。
4. 已知VK2细胞工厂中高水平MK生产策略
E. coli和B. subtilis是生物技术领域知名的生产多种代谢物（包括VK2）的工业菌株。本节总结了增强这两种菌株VK2产量的可用策略（表2），为克服L. lactis中VK2生产瓶颈提供参考。
4.1. E. coli中MK-7和MK-8的高水平生产
E. coli作为兼性厌氧微生物，因其生长快速和易于遗传操作而被广泛用作工业底盘菌株。E. coli中高水平MK生产策略主要集中在增强前体合成、阻断竞争途径和异源生物合成工程，为开发L. lactis高产策略提供了宝贵参考。E. coli的醌谱表现出培养条件依赖性：在好氧条件下主要合成泛醌-8（Q-8），而厌氧条件下以MK-8为主要产物。2011年，Kong和Lee通过调节前体合成和阻断竞争途径提高了MK-8产量。具体而言，过表达IspA（参与异戊二烯链延伸）、DXR（IPP生物合成的限速酶）和IDI（负责IPP与DMAPP间相互转化）使MK-8产量翻倍。此外，过表达萘醌环生物合成基因如menA和menB也显著提高了MK-8产量。Q-8生物合成途径中ubiC的突变使MK-8产量提高30%，而过表达menA和menD使产量提高5倍。最终在厌氧培养条件下实现了290 μg/g湿细胞重（WCW）的MK-8滴度。由于E. coli缺乏庚异戊二烯二磷酸合酶（HepPPS）而无法天然合成MK-7，Gao等通过引入异源MVA途径供给异戊二烯前体并过表达源自B. subtilis的HepPPS，首次实现了E. coli中MK-7的从头生物合成。调节HepPPS表达使MK-7产量提高2.3 μM，比原始菌株高22倍。删除ubiC、ubiA和ispB阻断了Q-7和Q-8生物合成的竞争途径。最终在5 L发酵罐中以葡萄糖为碳源、好氧条件下获得13.6 μM（8.8 mg/L）的MK-7滴度。
4.2. 芽孢杆菌属中MK-7的高水平生产
芽孢杆菌属菌株（特别是B. subtilis和B. subtilis natto）是食品级底盘菌株，可进行便利的遗传操作，使其成为MK-7生产的优良宿主。这些菌株的高产策略包括模块化工程、代谢调控、发酵优化和群体感应调控。作为MK-7生产最有利的宿主，B. subtilis产生的MK-7占其总VK2产量的90%以上。以B. subtilis 168为例，Yang等将MK-7生物合成途径分为四个模块：MK-7、莽草酸、甲基赤藓醇磷酸和甘油代谢途径。在另一项模块化工程研究中，B. subtilis的MK-7生物合成途径被分为五个模块。实施组合策略，包括过表达途径基因和抗反馈酶、删除竞争基因mgsA和araM、异源表达VHb。最终菌株BSMK_11在5 L发酵罐中达到281.4 ± 5.0 mg/L（12.0 mg/g干细胞重[DCW]）的MK-7滴度。过表达催化DHNA与庚异戊二烯侧链结合的MenA，在发酵120 h后产生6.6 ± 0.1 mg/L MK-7。过表达2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径基因（包括dxs、dxr和yacN）也显著提高了MK-7产量。基因dhbB编码双功能异分支酸裂解酶/芳基载体蛋白，在杆菌肽生物合成中将异分支酸转化为(2S,3S)-2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸（DHDHB），并与MK-7竞争共同前体异分支酸。删除dhbB缓解了前体竞争并减少了中间体消耗。因此，最终工程菌株在2 L挡板摇瓶中发酵144 h后产生69.5 mg/L MK-7。Ma等通过过表达不同限速酶组合构建了最优菌株，包括Dxs和Dxr，它们是MEP途径中供应MK-7侧链异戊二烯前体的关键限速酶。该策略使MK-7产量较原始菌株提高11倍（达到50 mg/L），证实MEP途径工程可有效增强MK-7生物合成。此外，Cui等构建了Phr60-Rap60-Spo0A群体感应（QS）系统以平衡细胞生长和产物合成，在摇瓶中达到360 mg/L的MK-7滴度，在15 L生物反应器中达到200 mg/L。Chen等过表达MEP途径中的五个基因，工程菌株BS20DFHG在摇瓶中产生415 mg/L MK-7。经发酵优化后，在50 L生物反应器中产量达到242 mg/L。
静置培养中的生物膜形成通过调节膜组成和电子传递促进MK-7合成。在此过程中，OxdC上调，产生更多甲酸作为电子供体以增强MK-7合成。在B. subtilis的MK-7生物合成过程中，搅拌式生物反应器中的比生产率和有效产物积累显著低于摇瓶。这归因于高流体动力学剪切应力、微环境异质性、代谢通量再分配、亲脂性产物损失以及放大策略不足，导致典型的放大衰减现象，即生物反应器滴度低于摇瓶结果。B. subtilis natto的高产MK-7也可通过发酵优化实现。经培养基优化后，产量达到62.32 ± 0.34 mg/L，在高转速搅拌和通气条件下增至226 mg/L。使用植物油作为消泡剂，MK-7以80%的回收率被原位回收，建立了一步生产富含MK-7的植物油的工艺，该油可直接用于食品生产，进一步增强了芽孢杆菌属的高产应用策略。
4.3. 提高L. lactis中VK2产量的展望
尽管E. coli和B. subtilis中的工程策略显著提高了VK2产量，但由于基本生理和遗传特性的种间差异，这些具体改造方案无法直接移植到L. lactis中，这是跨底盘工程策略普适性差的核心内在原因。原则上，L. lactis在长期乳品生态位中经历了还原性基因组进化，丢失了许多与碳流分支相关的基因，使其代谢网络高度精简，代谢冗余度低，缓冲代谢扰动的能力远弱于B. subtilis和E. coli。异源引入多基因合成模块（如L. lactis中缺失的MEP途径）可能引发碳代谢失衡和生长停滞。因此，已建立的E. coli和B. subtilis工程策略为提高L. lactis的MK产量提供了宝贵参考。
首先，可以精确阻断负责竞争性代谢分支（包括乳酸和支链氨基酸）的基因，以将胞内碳流导向MK合成，并在碳分配水平上增加前体池。同时，阻断乳酸途径导致糖酵解过程中产生的NADH积累；因此，NADH可能在转氢酶PntAB作用下转化为NADPH。其次，可通过可调启动子对menD和menF等限速基因进行位点特异性过表达，以缓解DHNA前体和异戊二烯侧链合成之间的通量不平衡。同时，可引入无痕点突变修饰生物合成酶的功能域，有效提高关键酶的催化活性和整体途径通量，以解除限速障碍。第三，模块化途径工程可将负责DHNA形成的上游莽草酸途径和提供异戊二烯侧链的MVA途径分为独立表达模块，同时增加两个前体分支的碳通量，打破MK生产瓶颈。第四，可应用动态控制从IPP需求角度平衡细胞生长和MK合成，如B. subtilis中利用QS系统所展示的那样。此外，工程化细胞膜以积累疏水性萜类产物的成功尝试可为工程化和改良微生物MK生产者提供新方向。
遗传操作工具对于在L. lactis中顺利实施可能的代谢途径改造不可或缺。在过去几十年中，已为乳酸菌开发了多种基因工程策略，包括基于质粒的表达系统、同源重组方法和先进的基因组编辑技术，极大地扩展了它们在合成生物学和代谢工程中的应用。现有综述已阐述了L. lactis的经典遗传修饰工具。在L. lactis中，传统遗传修饰方法主要依赖基于同源重组的策略，为功能基因组学和代谢工程奠定了基础；但这些方法通常需要大量筛选步骤，不适用于复杂基因组工程。基因组编辑技术的最新进展，特别是基于CRISPR-Cas9的系统，显著扩展了可用于L. lactis工程的遗传工具箱。通过引入序列特异性DNA切割并促进供体DNA介导的同源重组，CRISPR-Cas9可实现快速、可编程、无标记的基因组编辑，包括靶向基因缺失、插入和点突变。优化的CRISPR-Cas9平台已在代表性L. lactis菌株（包括MG1363和NZ9000）中成功建立，以简化的工作流程实现高效基因组修饰。最近，CRISPR/Cas9辅助的单链DNA重组工程与Cre/loxP系统相结合，在L. lactis中实现了无残留选择标记的大片段DNA整合。此外，鉴于食品工业对基因工程菌株的限制，自然水平基因转移模式重新受到关注，以获得可能用于实际应用的非基因工程菌株。例如，在乳球菌质粒pNP40和pUC11B中已鉴定出两个接合系统。经过优化的接合方案，转移频率比先前报道约高4000倍。另一个值得注意的自然水平基因转移模式是L. lactis的自然转化。在一些L. lactis菌株中，已鉴定出主能力调节因子ComX和参与自然转化的全套蛋白质。通过ComX的组成型过量产生，自然DNA转化可在L. lactis中发挥作用。总之，先进的基因组工程工具和潜在的水平基因转移模式将为L. lactis的精确途径重排和代谢优化提供坚实基础。
5. 总结
维生素K2（MK-n）是脂溶性维生素家族成员，对骨骼稳态和血管健康至关重要，长链MKs（n=5–13）比短链MKs具有更好的生物利用度。开发富含维生素K2的发酵食品具有重要的理论和实践意义，其中发酵乳制品可作为VK2的优良载体。L. lactis是生产长链MK的新兴食品级底盘，但与B. subtilis相比，L. lactis的VK2产量显著较低。近年来，通过优化培养条件、适应性实验室进化和简单的代谢工程修饰，VK2产量已有一定程度的提高。未来，阻断竞争途径、识别限速步骤、解偶联细胞生长和MK合成将有助于提高L. lactis中的VK2产量。
