《Environment International》：Analysis of ultra short-chain PFAS in urine: method development by LC-MS/MS and first human biomonitoring results from the German National Cohort (NAKO)
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环境与健康领域对链长为C1-C3的超短链全氟和多氟烷基物质（PFAS）的关注日益增加。其中，三氟乙酸（TFA, C2）是环境中检出最频繁的PFAS。本研究开发并验证了一种基于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的分析方法，用于同时定量测定人尿
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环境与健康领域对链长为C1-C3的超短链全氟和多氟烷基物质（PFAS）的关注日益增加。其中，三氟乙酸（TFA, C2）是环境中检出最频繁的PFAS。本研究开发并验证了一种基于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的分析方法，用于同时定量测定人尿液中五种超短链PFAS：三氟乙酸（TFA）、五氟丙酸（PFPrA）、三氟甲磺酸（TFMS）、全氟乙磺酸（PFEtS）和全氟丙磺酸（PFPrS）。研究人员利用德国国家队列（NAKO）汉堡研究中心提供的150名参与者的基线和五年随访点尿样（共300份）应用了该方法。研究中为TFA和PFPrA建立了第二个质谱产物离子跃迁，以在低分辨率质谱（LRMS）上实现可靠鉴定，并通过高分辨率质谱（HRMS）对49份随机选择的尿样进行了结果确证，两种方法间平均一致性为93%（SD = 12%）。TFA在100%的样本中被检出（基线中位数：22.5 μg/L；随访中位数：27.2 μg/L），中位浓度随时间显著增加约1.6倍（p < 0.0001）。TFMS在约8%的样本中定量检出，另有约73%的样本检出水平高于检出限（LOD）但低于定量限（LOQ）。PFPrA、PFEtS和PFPrS在所有样本中均未检出。基于尿液TFA水平估算的每日摄入量（DI）在第95百分位数范围为0.9–6.4 μg/kg体重/天，仍低于欧洲食品安全局（EFSA）设定的每日可接受摄入量（ADI）0.05 mg/kg体重/天。但有一名参与者的估算每日摄入量超过了ADI。本研究首次提供了德国一般人群超短链PFAS的纵向人体暴露数据，建立的稳健方法为未来更大规模的人体生物监测（HBM）研究奠定了重要基础。
论文解读
一、研究背景与目的
超短链全氟和多氟烷基物质（ultra short-chain PFAS，USC PFAS）是指碳链长度为C1-C3的一类全氟化合物。近年来，这类物质的环境与健康相关性受到越来越多的关注。其中，三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，C2）是环境中检出频率最高的PFAS，因具有高持久性和高迁移性，目前已在全球水循环中广泛分布，并可在多种植物及植物性食品中被检出。TFA的来源包括氟化气体的使用与降解、工业排放，以及含有C-CF3基团的化学品（如农用化学品和药物）的降解。然而，除TFA外，其他USC PFAS如五氟丙酸（perfluoropropanoic acid，PFPrA）、三氟甲磺酸（trifluoromethanesulfonic acid，TFMS）、全氟乙磺酸（perfluoroethanesulfonic acid，PFEtS）和全氟丙磺酸（perfluoropropanesulfonic acid，PFPrS）的研究数据仍然有限，其全球排放源尚未充分表征。
鉴于USC PFAS在环境中的普遍存在，人体暴露潜力巨大。TFA因极性结构，此前被认为具有较低的生物累积潜力，但可被快速吸收，持续性的非自愿暴露可能造成难以逆转的内暴露负担。近期，欧洲化学品管理局（ECHA）已根据CLP法规将TFA归类为生殖毒性和环境危害1B类，欧洲食品安全局（EFSA）则设定了TFA的临时每日可接受摄入量（acceptable daily intake，ADI）为0.05 mg/kg体重/天。然而，目前基于大规模人群的人体生物监测（human biomonitoring，HBM）研究依然匮乏，仅有少数研究报道了TFA和PFPrA在不同人群血清或尿液中的检出情况。从分析角度看，由于USC PFAS具有高极性、低分子量和高水溶性，其测定仍面临巨大挑战：保留时间极短、难以适用标准多组分PFAS方法；已有方法常受定量限过高和缺乏合适同位素标记内标等限制；尤为关键的是，TFA和PFPrA因碎片化有限而缺乏第二个产物离子跃迁，这妨碍了在低分辨率质谱（low-resolution mass spectrometry，LRMS）中进行可靠确证，增加了共洗脱干扰峰导致误判的风险。近期研究还报道了天然有机酸对TFA测定的潜在分析干扰。因此，本研究旨在开发一种能够可靠定量人尿中TFA、PFPrA及C1-C3全氟磺酸同系物的分析方法，并在德国国家队列（NAKO）中开展纵向HBM研究，评估德国一般人群的USC PFAS内暴露水平、人口学和人体测量学特征关联、时间趋势，并进行初步风险评估。
二、研究方法概述
本研究利用德国国家队列（NAKO）汉堡研究中心提供的生物样本开展分析。NAKO是德国最大的前瞻性队列研究，2014至2019年间在全国18个研究中心招募了204,733名参与者，其中汉堡登记10,111人；2019至2024年进行了五年随访，约138,000人参与。本研究作为先导研究，共分析150名参与者的300份尿液样本（基线和首次随访各一份），参与者年龄20–69岁，73%为男性。样本经离心分装后于?80 °C保存。分析方法采用高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），使用极性嵌入烷基固定相色谱柱在反相条件下进行梯度洗脱，配备两个延迟柱以分离系统性USC PFAS背景；质谱检测采用Sciex 5500 QTRAP系统，负离子模式下运行多反应监测（sMRM）模式。研究为五种分析物各选择两个离子跃迁（定量离子跃迁和确认离子跃迁），尤其为TFA和PFPrA实现了基于氟离子（m/z 19）的第二产物离子跃迁，这是本研究的重要方法学突破。此外，采用Orbitrap高分辨率质谱（HRMS）对49份随机选择样本进行结果确证。定量采用三个同位素标记内标（13C2-TFA、13C3-PFPrA和13C4-PFBS），并按DIN 32645标准评价检出限（LOD）和定量限（LOQ）。
三、主要研究结果
3.1 分析方法性能
在色谱方面，研究采用极性嵌入烷基相（Ultra-IBD柱），使TFA获得了良好的保留和峰形。流动相中添加缓冲液是获得对称峰形的关键。在LC-MS/MS方面，两种分析物的确认离子跃迁背景噪声极低，完全不受基质干扰，即使在低浓度水平下定量和确认跃迁的比值也符合预设容差范围。这是首次在HBM研究中可靠使用TFA和PFPrA的第二产物离子跃迁。值得注意的是，PFPrA的最优源参数与其他四种分析物差异显著，最终方法中PFPrA灵敏度损失约40%。HRMS确证结果显示，LRMS与HRMS浓度平均一致性为93%（SD = 12%），基质效应在HRMS中更弱。关于潜在干扰物顺式乙酰丙烯酸（cis-acetyl acrylic acid，CAA，m/z 113.0234），其出峰时间与TFA相差约0.8分钟，色谱分离完全。方法验证数据显示：线性范围约0.05–75 μg/L，相关系数R ≥ 0.998；TFA的LOD和LOQ分别为0.5和1.5 μg/L；所有分析物的日内精密度≤ 2.9%，日间精密度≤ 11.9%；平均相对回收率86–116%。此外，三实验室间比对研究显示TFA结果高度一致（变异系数2.4–17%），确证了方法的可靠性。
3.2 尿液浓度与人群特征
TFA在全部300份尿液样本中均有检出且100%高于LOQ。基线TFA中位浓度为22.5 μg/L（范围4.58–110 μg/L），随访中位浓度为27.2 μg/L（范围2.96–151 μg/L）。TFMS在约8%的样本中定量检出（> LOQ），另有约73%的样本检出水平高于LOD但低于LOQ。PFPrA、PFEtS和PFPrS在所有样本中均未检出。排除了17名肌酐值超出0.3–3 g/L范围的个体后，对133人进行了统计学分析。按性别分层分析显示，男性和女性之间TFA浓度无统计学显著差异。TFA浓度（无论是否经肌酐校正）均随年龄增长而增加，40岁以下与59岁以上年龄组间差异显著（基线p < 0.0001）。线性回归模型确认，基线TFA/肌酐值与年龄组显著相关（每10年增加14%），并与较低BMI和基线检查年份相关；基线TFA/肌酐每增加一个单位的BMI（例如从22.5增至23.5 kg/m2），TFA显著降低3%。在随访中，BMI仍与TFA/肌酐呈负相关，但基线TFA浓度是随访TFA浓度的最强预测因子（p = 0.0002）。
3.3 时间趋势
在平均5年（最长9年）的随访期间，TFA浓度（未校正和肌酐校正）在总体、男性和女性中均表现出统计学显著的上升（p < 0.0001），平均增加约1.6倍。这是首批证明TFA人体内暴露水平随时间增加的数据。TFMS由于阳性检出数较少无法推导时间趋势，但检出频率从基线约65%增加到随访约81%，提示暴露可能呈上升态势。
3.4 风险评估
基于尿液TFA水平，采用肌酐排泄法估算了每日摄入量（daily intake，DI）。根据尿排泄分数（fractional urinary excretion，FUE）假定的不同（完全排泄FUE = 0.99和不完全排泄FUE = 0.2两种情景），基线中位每日摄入量为0.4–1.8 μg/kg体重/天，随访为0.6–2.8 μg/kg体重/天，分别低于ADI的138倍至18倍。第95百分位数估算摄入量为0.9–6.4 μg/kg体重/天，仍低于ADI约56至8倍。然而，随访中一名参与者的最高估算每日摄入量（110 μg/kg体重/天，FUE = 0.99）超出ADI逾2倍，即使按FUE = 0.2估算也超ADI约11倍。
四、总结与讨论
本研究开发并验证了一种操作简便、结果可靠的LC-MS/MS方法，首次实现了人体尿液中五种USC PFAS（TFA、PFPrA、TFMS、PFEtS和PFPrS）的同时定量分析。方法的核心创新在于为TFA和PFPrA建立了基于氟离子碎片的第二个质谱跃迁，并通过HRMS确证，有效解决了因缺乏第二跃迁导致的LRMS确证难题，排除了CAA等天然干扰物的误判风险。与现有研究对比，本研究的TFA检出率和浓度水平与澳大利亚人群研究相当，均呈100%检出，确认了TFA暴露的全球普遍性。美国研究中较低的检出率可能与其较高检出限和回收率缺陷有关。本研究中PFPrA的未检出可能因LOD高于部分报道浓度，但不能排除其存在。TFMS的高检出频率（约81%）首次提供了其在人体尿液中存在的证据，结合其在德国饮用水中的广泛分布，提示TFMS应像TFA一样受到关注。未检出PFEtS和PFPrS与多数已有研究一致。TFA随年龄升高的趋势与澳大利亚研究结果相互印证，可能反映年龄相关的暴露模式、生理差异或毒代动力学特征。BMI与TFA/肌酐的负相关可能是肌酐校正造成的人为关联而非真实生物学效应。在风险层面，研究结果总体表明德国一般成年人TFA暴露量远低于EFSA的ADI值，但个案超标提示有必要通过长期HBM进行持续监测。研究的主要局限性包括：随机点尿样本受个体内变异影响；性别比例不均衡（73%为男性）；肌酐校正方法本身的局限性；仅两个时间点不足以捕捉完整的暴露动态；PFPrA的敏感性限制；以及TFA毒代动力学数据不足导致剂量反推的不确定性。结论指出，本研究是迄今规模最大、最全面提供TFA和TFMS个体水平纵向尿液HBM数据的研究，TFA的广泛暴露是一个国际上一致且稳定的现象，并预计会随环境污染加剧而进一步上升。未来该研究将继续扩大NAKO汉堡队列样本量，结合问卷数据分析社会经济变量和饮食习惯与TFA暴露的关联，并将分析对应的血浆样本以阐明内暴露动态和潜在生物累积。
该研究论文发表于《Environment International》。
