设计与合成新型肽类降解剂，针对野生型及FGFR1门控突变体，用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design and Synthesis of Novel Peptide-Based Degraders against Wild Type and Gatekeeper Mutants FGFR1 for the Treatment of NSCLC

　　• 通过筛选降解基序，优化了一种针对FGFR1的肽降解剂。• 2-3能够同等有效地降解野生型和gatekeeper突变（V561F/M）的FGFR1。• 2-3比抗体降解剂具有更好的渗透性和更低的免疫原性。• 这一策略可能也适用于其他具有抗性的膜蛋白。

引言
非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的约85%，主要由肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）组成，仍然是全球癌症相关死亡的主要原因(1)，(2)。基于铂的化疗长期以来一直是标准的一线治疗方法，但其生存益处有限且毒副作用较大(3)，(4)。最近对NSCLC驱动突变（如EGFR、ALK、BRAF、KRAS）的分子见解加速了靶向治疗的发展(5)。尽管包括吉非替尼、厄洛替尼和奥西替尼在内的EGFR抑制剂改善了患者的预后，但目前的靶向疗法仍未能实现持久和广泛的疾病控制(6)。
成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）已成为NSCLC中一个非常有前景的治疗靶点。临床研究表明，FGFR1基因扩增（8p12位点）出现在约17%的LUSC病例中(7)，(8)。这种基因改变导致FGFR1过度表达，并进而激活包括MAPK/ERK、PI3K/AKT和STAT通路在内的典型下游信号级联反应，从而促进肿瘤细胞的增殖、存活和上皮-间质转化。越来越多的证据表明，这些分子事件与NSCLC患者的不良预后密切相关(9)，(10)。I/II期试验表明，针对FGFR1的小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如fexagratinib（原称AZD4547）和infigratinib（原称BGJ398），表现出可接受的安全性，并且在某些患者中效果持续超过14个月(11)，(12)。更广泛地说，临床FGFR抑制剂的选择显著增加，几种FGFR抑制剂——erdafitinib、pemigatinib、futibatinib和tasurgratinib——已被批准用于FGFR改变的恶性肿瘤，突显了这一途径的治疗潜力。同时，正在积极开发具有改进的亚型选择性和/或耐药性的下一代FGFR抑制剂，包括FGFR2选择性抑制剂lirafugratinib（RLY-4008）、FGFR3选择性抑制剂LOXO-435和TYRA-300以及FGFR2/3选择性抑制剂KNT-0919(13)，(14)。然而，上述FGFR1靶向TKIs的整体疗效仍然有限，疾病控制率仅为26-39%(15)，并且许多患者会出现原发性和获得性耐药性(16)。值得注意的是，FGFR1-V561F/M gatekeeper突变已被确定为对多种FGFR1靶向TKIs耐药的关键机制(17)，(18)，(19)。类似激酶结构域gatekeeper突变的普遍存在，例如EGFR T790M在EGFR-TKI耐药中的作用，强调了gatekeeper突变作为靶向癌症治疗主要挑战的重要性(20)，(21)。因此，开发能够克服FGFR1扩增NSCLC中耐药性的新型FGFR1靶向治疗剂具有重要的临床和转化意义。
靶向或受体结合肽相比小分子TKIs和单克隆抗体具有多种优势，包括易于合成、低免疫原性、高选择性和可预测的代谢行为(22)，(23)。最近的技术进步，如噬菌体展示、人工智能驱动的设计和高通量筛选，加速了FGFR靶向肽的发现(24)，(25)，(26)。反映这一进展，已经报道了几类细胞外FGFR结合分子，包括来自FGF的受体结合肽、噬菌体展示衍生的肽结合剂以及最近设计的FGFR c-亚型选择性迷你蛋白，从而突显了选择性靶向细胞外FGFR家族成员的可行性(27)。然而，与其他受体结合肽一样，FGFR靶向肽在体内实现强效抗肿瘤活性时面临重大障碍。首先，并非所有已鉴定出的靶标结合肽都能结合蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的关键“热点”或其别构位点，从而限制了它们抑制FGF-FGFR信号传导的能力(28)。其次，它们的内在特性，包括易受蛋白水解降解和快速肾清除，进一步降低了治疗效果(29)，(30)。因此，人们投入了大量努力来克服这些限制。例如，肽-药物轭合物通过共价连接效应分子（如化疗剂或放射性药物）来实现选择性肿瘤细胞杀伤(31)。为了提高代谢稳定性，采用了多种结构修饰策略，包括主链修饰、侧链工程和环化，以显著增强体内稳定性和药代动力学性能(32)。此外，我们的团队最近提出了一种半抗原修饰策略，其中DNP修饰的目标肽可以结合并招募内源性循环抗体，从而触发免疫效应机制，如补体依赖性细胞毒性，并增强对NSCLC的协同抗肿瘤活性(33)。尽管取得了这些进展，仍需要新的功能化策略，使FGFR1靶向肽能够在不依赖于PPI位点占有的情况下中断FGFR信号通路，为非PPI靶向的FGFR1肽治疗开辟新的途径。
近年来膜蛋白降解技术的发展将靶向降解扩展到了细胞表面蛋白，从而为治疗干预创造了新的机会(34)，(35)。一个里程碑式的例子是Bertozzi及其同事首创的溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）策略，该策略利用溶酶体靶向受体的配体来驱动细胞外或膜相关靶标的内化和溶酶体降解(36)。后续的方法，包括AbTACs、KineTACs、iLYTACs及相关系统，进一步扩展了膜蛋白降解的范围，但通常依赖于辅助内化受体的表达，而这些受体在不同组织和肿瘤类型中的表达可能有所不同(37)，(38)。与受体介导的膜蛋白降解技术并行，先前的研究确立了SignalTAC概念，即直接将溶酶体分选基序附加到目标结合配体上，通过内源性转运机制促进膜蛋白的溶酶体降解(39)，(40)，(41)，(42)。重要的是，这种策略已经在基于抗体、纳米体和肽的格式中得到验证，使用了如CI-M6PR衍生的二肽基序、基于酪氨酸的转运基序和伴侣介导的自噬（CMA）相关的靶向序列(43)，(44)，(45)。这种方法特别有趣，因为FGFR1的降解可以在不直接阻断典型配体-受体接口的情况下抑制FGF2–FGFR1信号传导，并通过靶向细胞外域，可能保持对减少FGFR TKIs敏感性的激酶结构域gatekeeper突变体的活性。
在这里，我们应用了一种基于SignalTAC的设计策略来设计FGFR1，从已知的FGFR1结合肽Pep1构建了一系列基于肽的FGFR1降解剂（Pep-SignalTACs），该肽已被报道可以结合FGFR1c的细胞外域(33)。通过系统地比较同一肽骨架上的多种溶酶体分选和伴侣介导的自噬（CMA）相关基序，我们鉴定出Pep-SignalTAC 2-3是一种有效的降解剂，在体外能够快速下调FGFR1并比母体结合剂更强烈地抑制下游信号传导。值得注意的是，Pep-SignalTAC 2-3在工程化的FGFR1 V561F/M gatekeeper突变模型中也保持了活性，支持了细胞外受体降解可以绕过FGFR靶向TKIs主要耐药机制的观点。此外，Pep-SignalTAC 2-3在体外与临床使用的FGFR抑制剂表现出组合抗肿瘤活性，尽管程度有限。为了进一步提高体内效果，我们开发了两种长效形式的Pep-SignalTAC 2-3，包括一种二硫键连接的疏水性烷基链修饰变体和一种基于水凝胶的制剂，这两种形式旨在理论上提高血浆暴露量和/或肿瘤选择性，从而增强抗肿瘤效果(46)。总体而言，本研究将已建立的SignalTAC设计原理扩展到了针对FGFR1的肽骨架，并为携带gatekeeper突变的FGFR1扩增NSCLC提供了一种基于肽的受体降解策略。

设计与构建Pep-SignalTACs——基于FGFR1结合肽的降解剂
Pep-SignalTACs平台的设计如图1a所示。之前表征的FGFR1靶向肽YRSRKYSSWYVALKR（Pep1）被用作靶向骨架(33)。选择了三种独立的溶酶体定向模块DSPs（图1b），这些模块不依赖于细胞表面的溶酶体靶向受体。为了促进DSPs的细胞内递送，在N端加入了一个具有细胞穿透能力的肽序列RRRRRRRRRR或RRRK。

讨论与结论
获得性耐药性的出现仍然是临床管理FGFR1驱动的非小细胞肺癌（NSCLC）的一个严峻挑战。虽然酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）可以提供最初的临床益处，但它们的持久性常常受到多种耐药机制的限制。其中，如FGFR1 V561F/M这样的gatekeeper突变特别成问题，因为它们在ATP结合口袋内引入了空间障碍，从而影响抑制剂的结合。

材料
二异丙基碳二亚胺（DIC）、氰基甘氧基酸-2-肟（Oxyma）、Fmoc保护的氨基酸和Rink酰胺MBHA树脂从GL Biochem（中国上海）购买。三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIPS）和荧光异硫氰酸酯（FITC）从J&K Chemical Technology Co., Ltd.（中国北京）购买。针对FGFR1（9740S，CST）、FGFR2（23328S，CST）、FGFR3（4574S，CST）、FGFR4（8562S，CST）、p-FRS2（3864S，CST）、p-PLCγ（14008S，CST）、p-ERK1/2（CRedi）

作者贡献声明
戴世杰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资源管理，项目管理，资金获取，数据管理，概念化。
蔡月宝：监督，资源管理，项目管理，概念化。
刘海燕：撰写 – 原稿，监督，资源管理，项目管理，研究，数据管理，概念化。
陈 Yingqun：方法学，数据管理。
杨文举：方法学，数据管理。
陈一珠：方法学。

伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获得温州医科大学动物护理和使用委员会的批准（批准号：wydw2026-0003）。

利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：82204217）和温州基础科学研究计划项目（GK20250018）的支持。本研究还得到了浙江省重点学科建设项目（温州医科大学-药学）的部分支持。我们感谢温州医科大学科研中心和温州中医药研究与转化重点实验室在咨询和仪器提供方面的帮助。

Ziyu Tian | Luwei Fu | Xuanxuan Yan | Yizhu Chen | Wenju Yang | Yingqun Chen | Haiyan Liu | Yuepao Cai | Shijie Dai