吲哚并吡唑并咔唑衍生物的合成、抗癌活性、Pim-3抑制效力及斑马鱼幼鱼毒性评价

《European Journal of Medicinal Chemistry Reports》：Synthesis, anti-cancer activity, Pim-3 inhibitory potency and zebrafish larvae toxicity evaluation of indolopyrazolocarbazole derivatives

　　

研究人员合成了一系列吲哚并[2,3-a]吡唑并[3,4-c]咔唑衍生物，并在核心骨架的N₁₂和N₁₃位氮原子间引入含有半缩胺、半缩胺醚和缩醛胺(aminal)官能团的三碳桥。在急性髓系白血病(AML)细胞系MOLM-13中评估了化合物的细胞毒性，其中9位取代的化合物25、26和29表现出最强的抗增殖活性，其半数抑制浓度(IC₅₀)分别为0.015、0.064和0.016 μM。进一步在神经母细胞瘤(NBL)细胞系MHH-NB-11和LAN-5中测试，三个化合物的IC₅₀介于0.51至1.3 μM。此外，所有化合物在1 μM浓度下对Pim-3蛋白激酶均显示残余活性低于50%，其中17个化合物对Pim-3的IC₅₀在7–50 nM范围，化合物5和22的IC₅₀分别为8.6和7.5 nM。斑马鱼幼鱼毒性实验显示，所选化合物的半数致死浓度(LD₅₀)约为50–200 μM，较其抗肿瘤IC₅₀高出50–500倍，提示具有可接受的治疗窗口。该研究证实吲哚并吡唑并咔唑骨架是开发新型抗AML及高危NBL药物的可行平台。

**研究背景与目的**

急性髓系白血病(AML)传统化疗方案虽可诱导缓解，但缓解持续时间短、毒性大，老年患者5年总生存率不足15%。尽管近年来靶向治疗兴起，但新疗法依然稀缺，仍需开发新型抗AML药物。蛋白激酶失调是AML等肿瘤的重要特征，小分子激酶抑制剂已成为关键策略。研究人员此前报道的吲哚并[2,3-a]吡唑并[3,4-c]咔唑类化合物——即星形孢菌素苷元K252c的吡唑类似物——对Pim-3蛋白激酶和AML细胞具有高效活性，但存在水溶性差和细胞毒性中等的问题。先导化合物1在N₁₂位引入甲基氨基丙基链后，对MOLM-13、OCI-AML3和MV4-11等AML细胞系表现出亚微摩尔级活性，并对多种蛋白激酶具有纳摩尔级抑制作用。在此基础上，本研究进一步设计在N₁₂与N₁₃之间引入官能化三碳桥，系统评价新衍生物的AML、神经母细胞瘤(NBL)细胞毒性、Pim-3抑制效力及斑马鱼幼鱼毒性，探索该类化合物作为抗肿瘤药物进一步开发的潜力。论文发表于《European Journal of Medicinal Chemistry Reports》。

**主要技术方法**

研究人员以乙基2-(吲哚-3-基)乙酸酯为起始原料，经光诱导环化/氧化等多步反应获得关键中间体3和4；在氧化裂解烯烃时意外获得半缩胺5和6。利用半缩胺化学，通过胺解、醇解、溴代醇取代、叠氮化及铜催化叠氮-炔环化(CuAAC)等反应合成了含半缩胺、半缩胺醚、缩醛胺、氨基烷氧基及三氮唑等官能团的系列衍生物7–30。生物活性方面：①采用WST-8代谢活性法检测化合物对AML细胞系MOLM-13（ACC 554，来自DSMZ）的细胞毒性；②对活性最强的化合物25、26和29在NBL细胞系MHH-NB-11（ACC 157）和LAN-5（ACC 673）中测定72小时细胞毒性；③在苏格兰丹迪国际激酶谱中心(ICKP)测定化合物对Pim-3的体外抑制活性；④以斑马鱼AB品系胚胎（来自卑尔根大学）进行48小时暴露的幼鱼毒性实验并计算LD₅₀；⑤对(R)-22和(S)-22进行分子对接，分析其与Pim-3 ATP结合口袋的相互作用模式。

**研究结果**

**细胞毒性评价**：在MOLM-13细胞中，化合物5–16、18–23和25–30的24小时细胞毒性明显依赖于9位或11位取代基，9位取代物总体优于11位。其中9位含2-氨基乙氧基、2-(甲基氨基)乙氧基和2-(乙氨基)乙氧基取代的化合物29、25和26活性最高，IC₅₀分别为0.016、0.015和0.064 μM。三种化合物在NBL细胞系中亦显示活性，IC₅₀为0.51–1.3 μM，与克唑替尼在ALK突变NBL模型中的活性水平相当。

**Pim-3抑制效力**：所有化合物在1 μM时对Pim-3的残余活性均低于50%，其中17个化合物残余活性小于10%，IC₅₀为7–50 nM。半缩胺5和2-氨基乙氧基衍生物22活性最强，IC₅₀分别为8.6 nM和7.5 nM。总体来看，11位取代比9位取代更有利于Pim-3抑制；缩醛胺7–12和半缩胺醚13–16活性较5下降；但乙氧基被氨基乙氧基替代后抑制活性回升，趋势为NH₂ > NHMe > NHEt > NMe₂。分子对接表明，化合物22的质子化氨基乙氧基链可伸向激酶催化域C端叶，与Asp131、Glu174形成盐桥，解释了该基团带来的效力增益。

**斑马鱼幼鱼毒性**：对化合物15、25、26和29的毒性检测显示，不同化合物的致死动力学存在差异。化合物15在24小时时LD₅₀ > 200 μM，48小时降至50 μM；化合物25作用迅速，24与48小时致死率无差异；化合物26和29毒性有轻度延迟；48小时时化合物29的LD₅₀最高。总体而言，LD₅₀较NBL细胞IC₅₀高约50–100倍，较MOLM-13细胞IC₅₀高500倍以上，提示治疗窗足以支持进一步的体内AML或NBL模型研究。

**讨论与结论**

讨论指出，尽管Pim-3是先导化合物1的重要靶点，但Pim-3抑制活性并不能完全解释25、26和29更强的细胞毒性，因为9位取代（对Pim-3抑制不如11位）却带来更优的细胞活性。研究人员认为，这一差异可能源于氨基乙氧基改善的理化性质、细胞内稳定性以及对其他生物靶点的多靶点作用。此外，在N₁₂与N₁₃间引入桥并未损害Pim-3抑制效力，反而提供了新的结构修饰位点。结论部分翻译如下：K252c的吡唑类似物（12,13-二氢-5H-吲哚并[2,3-a]吡唑并[3,4-c]咔唑）的合成推动了具备改善理化性质和对AML细胞系高效活性衍生物（如1）的开发。本研究利用来自化合物3和4的醛环化为半缩胺5和6的能力，制备了含有半缩胺醚和缩醛胺官能团的新型衍生物7–30。针对MOLM-13的细胞毒性筛选发现了高活性的25、26和29，IC₅₀分别为0.015、0.064和0.016 μM；它们在两个NBL细胞系中也显示微摩尔级活性。对Pim-3的检测表明，引入桥保留了高抑制活性（如22的IC₅₀为7.5 nM，29为13.8 nM）。但Pim-3抑制结果不能解释25、26和29更高的细胞活性，提示理化性质或其他生物靶点可能发挥作用。斑马鱼幼鱼毒性评价支持这些化合物在AML和NBL模型中具有良好治疗窗口。总之，该研究确认吲哚并[2,3-a]吡唑并[3,4-c]咔唑骨架对进一步开发高效且毒性低的抗肿瘤药物具有很高价值。