雷巴米普德纳米悬浮液负载的原位凝胶：一种旨在改善干眼症眼部给药疗效的新兴策略

《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》：Rebamipide Nanosuspension Loaded In Situ Gel: A Promising Strategy to Improve Ocular Delivery and Treatment of Dry Eye Disease

　　摘要
目的：瑞巴米普（REBA）用于治疗干眼症（DED），并以Mucosta?眼科悬浮液的形式在日本广泛使用。然而，在局部滴用后观察到了一些挑战，如视力模糊、由于颗粒较大导致渗透性降低、由于鼻泪道引流需要频繁给药以及药物有苦味。因此，在本研究中开发了含有原位凝胶的瑞巴米普纳米悬浮液（REBA-NS gel），以解决这些问题并提高用药便利性。

方法：
使用酸碱中和法制备REBA-NS，并以HPMC作为稳定剂，通过质量设计（quality-by-design, QbD）方法进行优化。对REBA-NS进行了进一步的表征和评估，然后将优化的REBA-NS装载到凝胶中，所使用的凝胶在接触模拟泪液后能够形成原位凝胶。最后，对REBA-NS gel进行了体外和体内研究。

结果：
REBA-NS具有纳米级颗粒（<270 nm），这可能有助于提高渗透性；其多分散指数（polydispersity index, PdI）较低（<0.25），药物含量较高（>80%）。此外，REBA-NS gel表现出黏附性、持续的药物释放、无菌特性以及适合眼部给药的适宜pH值（约7.2）和渗透压（约216 mOsm/kg），这些都有助于REBA的保留。在治療第7天，与REBA溶液相比，REBA-NS gel在患有DED的大鼠实验中显示出泪液分泌增加和角膜荧光评分分别降低了1.39倍和9.12倍。

结论：
总之，REBA-NS gel被证明是治疗DED的一种有前景的方法。

引言：
干眼症（DED）是一种以泪膜不稳定为主要特征的复杂疾病。根据最新数据，估计40岁以上的人口中有10-20%患有中度至重度的DED症状。东亚、高加索和印度人群中DED的患病率分别为16.7-33.4%、8.7-11%和26.2%。研究还表明，老年人和女性是DEM的风险因素。尽管该疾病的根本原因尚不明确，但黏蛋白生成不足是其发展和发病的关键因素，而过度泪液蒸发会损伤眼睑间的眼球表面。泪液渗透压升高会导致炎症、视觉障碍以及对眼球表面的严重损伤。眼睛表面会释放出多种炎症因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，这些因子会吸引中性粒细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞，从而引发更多的炎症反应，形成恶性循环。视力模糊、刺激感、炎症、神经感觉器官异常以及眼球表面损伤都是DED的症状。

瑞巴米普（REBA）广泛用于治疗消化性溃疡，其细胞保护机制通过增加产生高分子量糖蛋白的酶的活性来促进溃疡愈合，从而增强胃黏蛋白的合成。类似的机制也适用于DED，例如黏液生成减少、由于持续性炎症导致结膜杯状细胞退化以及泪膜稳定性下降。一些研究报道了REBA在治疗DED方面的有效性，这突显了进一步研究的必要性。REBA的机制包括增加膜相关黏蛋白（MUC1和MUC4基因）的分泌，从而促进黏蛋白的产生，防止微绒毛损伤，降低高渗透压，并增加杯状细胞的增殖和密度。此外，它通过减少多形核淋巴细胞产生的超氧阴离子和氧自由基以及抑制促炎细胞因子（如NF-kB、TNF-α和IL-8）的合成来改善局部血液循环。大冢制药公司在日本推出了REBA作为Mucosta?（2%眼科悬浮液）用于DED治疗。然而，仍存在一些挑战，如视力模糊、由于颗粒较大导致渗透性降低、由于鼻泪道引流需要频繁给药以及药物有苦味。为了解决这些问题，将药物精准输送到目标部位至关重要。

纳米悬浮液（NS）是一种常用的药物输送系统，相比传统剂型具有许多优势，如粒径更小、全身毒性降低、能够更方便地穿越生理屏障、避免用药后的视觉模糊以及减少制剂流失。使用适当的聚合物/稳定剂（如羟丙基甲基纤维素HPMC、壳聚糖CS、羧甲基纤维素CMC和各种纤维素衍生物）制备NS可以延长黏膜接触时间并改善膨胀性，从而有利于药物释放动力学。然而，单独使用NS会导致眼部药物保留减少和泄漏。因此，将NS结合到原位凝胶中是一种有前景的方法，可以增加前角膜停留时间并便于局部给药。在这方面，壳聚糖可以用作离子敏感的凝胶化剂，因为它在接触泪液中的阳离子时会从溶胶状态转变为凝胶状态，从而增强药物在眼球表面的保留。基于上述聚合物和稳定剂的优点，我们推测含有原位凝胶的REBA-NS适合用于治疗DED。为此，使用HPMC作为稳定剂，并通过Box-Behnken设计（BBD）进行优化。对REBA-NS进行了进一步的表征和评估，然后将优化的REBA-NS装载到含有壳聚糖的凝胶中。最后，对REBA-NS gel进行了体外和体内研究，结果显示其具有持续的药物释放、黏附性以及在治疗DED的大鼠模型中改善的治疗效果。

材料：
瑞巴米普（REBA）从印度TCI公司购买；HPMC和壳聚糖从印度Yarrow Chem公司购买；透析膜（12 kDa MWCO）、盐酸和荧光素钠从美国Sigma Aldrich公司购买；氢氧化钠和海藻糖从印度Himedia公司购买。本研究使用的所有其他化学物质的纯度均大于95%。

瑞巴米普纳米悬浮液（REBA-NS）的制备：
REBA-NS采用酸碱中和法制备，随后进行高压均质化处理。将REBA（1% w/v）溶解在NaOH溶液（0.1M）中形成碱性相，将0.25-0.75% w/v的稳定剂（HPMC）溶解在HCl溶液（0.1-1M）中形成酸性相。然后在磁力搅拌（500-1000 rpm）下将REBA-碱性相缓慢加入稳定剂-酸性相中，持续30分钟。混合完成后，调整制剂的pH值。

通过质量设计（QbD）方法优化REBA-NS：
QbD方法包括确定产品质量目标（QTPP）、关键质量属性（CQAs）、关键工艺参数（CPPs）和风险评估。REBA-NS的QTPP要素在补充表S1中列出。此外，还分析了工艺与产品之间的可能因果关系，即REBA-NS的CMA、CPPs和CQAs。

REBA-NS的实验设计优化：
根据先前的研究，选择了独立变量（CMA和CPPs）对REBA-NS的依赖变量（CQAs）的影响。经初步筛选确定的显著因素包括稳定剂浓度、HPH压力和循环次数对颗粒大小和PdI等依赖变量的影响，并使用BBD设计技术进行了评估。

颗粒大小、PdI和药物含量的测定：
使用Zetasizer（Nano ZS, Malvern）的DLS技术测定REBA-NS的颗粒大小和PdI。分析前将REBA-NS用milli Q水稀释十倍。分析在25°C下进行。为了测定药物含量，将REBA-NS超声处理（40%幅度，开关10秒/次，共5分钟），然后离心（10,000 rpm，30分钟），去除上清液，最后在UV-1900分光光度计（Shimadzu）中测量227 nm处的药物含量。

溶解度研究：
采用摇瓶法测定REBA-NS的溶解度。分别向1 mL milli Q水中加入过量的REBA和冻干REBA-NS，然后在轨道摇床（IKA）中以100 rpm转速振荡24小时。24小时后离心，通过UV-1900分光光度计在227 nm处分析上清液。

REBA-NS的表征方法：
详细描述了使用FE-SEM、FT-IR、DSC和XRD对REBA-NS的表征方法。

含有原位凝胶的REBA-NS（REBA-NS gel）的制备：
使用壳聚糖作为凝胶化剂制备REBA-NS gel。选择壳聚糖是因为它在与模拟泪液（STF，成分：氯化钠0.68% w/v、碳酸氢钠0.22% w/v、氯化钙二水合物0.008% w/v、氯化钾0.14% w/v的milli Q水）接触后能形成凝胶。向REBA-NS中加入0.4% w/v的壳聚糖（即每10 mL REBA-NS中加入40 mg壳聚糖），在80°C下以500 rpm磁力搅拌10分钟。

澄清度和凝胶形成能力：
在黑色背景下观察REBA-NS gel的澄清度。测量REBA-NS gel（0.2、0.3、0.4、0.5和1% w/v壳聚糖）与STF（25:7 v/v混合前后的凝胶形成时间。选择壳聚糖的量基于其与STF混合后的凝胶形成情况和性质。选择的比为25份壳聚糖对7份STF，以模拟实际环境中的聚合物溶液（25 mL）与泪液的混合情况。

体外药物释放研究和动力学建模：
使用透析袋法进行REBA分散液（0.75% w/v in milli Q水）、REBA-NS和REBA-NS gel的体外药物释放研究。将REBA-NS（1 mL）和REBA-NS gel（1 mL）分别加入透析袋中，密封后置于含有0.1% v/vTween 20的40 mL STF培养基中，37°C下孵育12小时。在不同时间点（0.25、0.5、1、2、4、8和12小时）取出样品进行分析。

体外渗透研究：
使用新鲜切下的山羊角膜（扩散面积为2 cm2）进行REBA从REBA分散液（0.75% w/v in STF）和REBA-NS gel的体外渗透研究。山羊眼球从屠宰场获取，去除角膜后用于渗透研究。将角膜安装到Franz扩散池中，渗透液含有pH 7.4和0.1% v/v Tween 20。每个池中分别放置1 mL的REBA分散液和REBA-NS gel。

DED的诱导：
通过不同浓度的苯扎氯铵（0.2%、0.5%、0.8%和1% v/v）诱导大鼠的DED。低浓度的苯扎氯铵不足以诱发DED，但每天两次（上午10点和下午4点）局部给予1%苯扎氯铵持续4天后可诱发DED。建立模型后，每天局部给予一次REBA溶液（0.75% w/v）和REBA gel，持续7天。

体内治疗效果：
在Sprague-Dawley（SD）大鼠模型中评估REBA-NS gel的治疗效果。将SD雌性大鼠（180-220 g）分为四组，每组六只动物，分别为阴性对照组（无处理）、阳性对照组（已诱导DED）、REBA溶液组（已诱导DED，然后使用REBA溶液治疗）和REBA-NS gel组（已诱导DED，然后使用REBA-NS gel治疗）。

泪液分泌量的测定：
使用Schirmer泪液测试条（OpStrip, Wizcure Medical Devices Pvt. Ltd.）测定泪液分泌量。简单地将0.5% w/v普鲁卡因HCl的眼部麻醉剂滴入大鼠眼中，用软纸吸除多余液体，然后将测试条放置在结膜囊中30秒。记录了湿带的长度，并对健康对照组、DED诱导组和REBA溶液（0.75%角膜荧光素钠（SF）染色的双眼进行了平均测量值。为了确定角膜荧光素染色情况，将5 μL的SF溶液滴在大鼠的眼表上。手动闭合麻醉大鼠的眼睑以分布荧光素染色剂。使用便携式裂隙灯（PSL-D20，Remidio，印度）在蓝光下观察眼睛，可见有眼部损伤的区域呈现绿色荧光。将角膜分为四个象限，并按照Qiao等人[5]、[37]的报道进行评分。

伦理声明
所有使用的动物均得到了古瓦哈提NIPER的IAEC批准（NIPER/CAF/IAEC/2024/02）。山羊眼球是从当地屠宰场获得的，因为这些动物并非专门为研究目的而安乐死，摘除角膜是为了进行渗透研究。

REBA-NST的优化
在确定了因素[稳定剂浓度（A）、HPH压力（B）和HPH循环次数（C）对响应[颗粒大小（Y1）和PdI（Y2）]的影响后，使用BBD方法对REBA-NS进行了优化。考虑了独立变量包括稳定剂浓度（0.25-0.75%）、HPH循环次数（6-12次）和压力（12,000-18,000）。研究了独立变量对颗粒大小和PdI响应的影响。共制定了18种配方。

REBA-NST的颗粒大小、PdI和药物含量
优化后的REBA-NS的颗粒大小为266.9 ± 2.92 nm，PdI为0.217 ± 0.015，zeta电位为-5.56 ± 0.27 mV，这表明了REBA-NS的纳米尺寸和单分散性（图3A和3B）。此外，REBA-NS的低zeta电位可能归因于用作稳定剂的HPMC的空间阻碍[38]。通过紫外-可见光谱仪进一步确定了REBA-NST的药物含量，此前已对REBA进行了部分验证。

FE-SEM形态学研究
通过FE-SEM分析了REBA和REBA-NS的形态，如图3C1和3C2所示。原始REBA具有棒状颗粒，Xiong等人也报告了类似的观察结果[25]。然而，在将REBA制备成纳米悬浮液REBA-NS后，观察到略微球形的纳米颗粒。这些纳米颗粒可能有助于提高REBA在水中的溶解度或增强其跨角膜的渗透性。

FT-IR研究
REBA、HPMC、物理混合物和REBA-NS的FT-IR光谱见补充图S3A。REBA在3630.03 cm-1和3549.03 cm-1处显示出特征峰，分别对应于N-H伸缩、3275.13 cm-1处的CH2伸缩、1539.20 cm-1处的酰胺基团N-H弯曲、1643.35 cm-1和1728.22 cm-1处的酰胺C=O伸缩，这与文献报道一致[11]。HPMC的FT-IR光谱也与文献结果相符。

DSC研究
通过DSC研究观察到REBA从晶体形式向非晶形式的相变。REBA、HPMC和REBA-NS的DSC热图见补充图S3B。REBA在307.32 °C处显示出明显的吸热峰，表示药物的熔点。然而，HPMC和REBA-NS在约60 °C处显示出宽吸收峰。REBA在REBA-NS中吸热峰的消失表明晶体REBA可能完全转化为非晶形式。

XRD研究
REBA、HPMC、NaCl、物理混合物和REBA-NS的衍射图见补充图S3C。REBA在8.3°、10.9°、12.4°、14.9°和18.0°处显示出明显的晶体峰，而HPMC没有明显的峰，表明其非晶性质。

溶解度研究
为了观察纳米悬浮液形成后的溶解度增加情况，对原始REBA和冻干REBA-NS的水溶性进行了测试。如图4A和补充表S6所示，原始REBA的水溶性较低（0.0006 ± 0.001 mg/mL），而REBA-NS的水溶性为16.108 ± 0.334 mg/mL。因此，REBA-NS的溶解度比原始REBA提高了26,000倍。这可能是由于REBA-NS的非晶性质和纳米化。

透明度和凝胶化能力
透明度和凝胶化能力是原位凝胶的重要参数。在这里，使用吉兰胶作为凝胶剂制备了REBA-NS的原位凝胶。选择吉兰胶是因为它能在与泪液中的离子（钙、镁、钾和钠）接触后形成凝胶，即与STF接触时形成凝胶。因此，凝胶化是由于吉兰胶的相变行为所致。

pH值、药物含量和流变学研究
优化后的凝胶的pH值为7.2 ± 0.3，适用于眼部配方且眼睛可以耐受[46]。此外，制备的凝胶中药物含量为84.30 ± 1.86%，表明凝胶中药物浓度较高。

流变学研究
流变学研究是关于液体流动阻力的研究，用于确定剪切应力与剪切速率之间的关系。补充图S5显示了添加STF与否时REBA-NS凝胶的流变行为。

渗透压测定
需要评估渗透压，以防止高渗透压导致的不适、眼表损伤和眼睛刺激。人眼可以耐受200至500 mOsm/kg之间的渗透压值[30]。因此，在制备的凝胶中加入了不同浓度的海藻糖（1%、2%、3%和4% w/v）作为渗透压调节剂。

体外药物释放研究和动力学建模
通过透析袋方法在STF中测定了REBA从REBA分散液、REBA-NS和REBA-NS凝胶中的释放情况。如图4B所示，REBA分散液在12小时内的释放量为84.11 ± 3.14%。然而，REBA-NS在12小时内的持续释放量为60.47 ± 0.46%，REBA-NS凝胶的释放量为58.54 ± 4.55%，这可能是由于REBA-NS的纳米化导致REBA的溶解度增加。

体外渗透研究
在山羊角膜上进行了REBA从REBA分散液和REBA-NS凝胶中的渗透研究。REBA分散液在12小时内通过2 cm2角膜区域的累积渗透量为1030.76 ± 13.08 μg cm-2，REBA-NS凝胶为1550.75 ± 17.89 μg cm-2。REBA-NS凝胶的滞后时间（约95分钟）比REBA分散液（约35分钟）长，这可能是由于聚合物凝胶的存在。

黏附性研究
黏附性在眼部配方中的重要性在于它可以通过附着在眼睛上延长药物在眼中的驻留时间，从而延长药物释放时间并提高治疗效果[51]。因此，通过流变协同作用方法确定了制备凝胶的黏附性。黏蛋白分散液（ηm）、REBA-NS凝胶（ηp）以及黏蛋白分散液和REBA-NS凝胶的混合物（ηt）的粘度分别为5.63 ± 0.72 mPa·s、20.07 ± 4.19 mPa·s和81.63 ± 20.20 mPa·s。

无菌测试
无菌测试对于眼科配方至关重要，用于评估是否存在微生物污染。通常使用高压灭菌和/或过滤来获得无菌环境。在本研究中，对制备的凝胶进行了高压灭菌，发现高压灭菌过程未改变凝胶的性质，且REBA的λmax在灭菌前后保持不变（补充图S6A）。

储存稳定性研究
储存稳定性研究是确定制备配方是否需要冷藏或室温储存条件的重要因素。进行了为期30天的初步短期储存稳定性研究，以评估所开发原位凝胶配方的初始稳定性。在研究过程中监测了pH值、药物含量和外观等关键参数。

体外细胞毒性研究
在进行动物研究之前，需要对特定配方的安全性进行评估。因此，使用HCE细胞评估了REBA溶液（0.75% w/v）、REBA-NS和REBA-NS凝胶的细胞毒性。如图5所示，当浓度低于50 μg/mL时，REBA溶液、REBA-NS和REBA-NS凝胶的细胞存活率均超过100%。因此，REBA溶液、REBA-NS和...

体内治疗效果
在DED大鼠中评估了REBA-NS凝胶的治疗效果，包括泪液分泌量测试和角膜荧光素钠染色测试。所有四个治疗组（阴性对照组、阳性对照组、REBA溶液组和REBA-NS凝胶组）之间进行了比较。在治疗前和治疗期间进行了眼部临床检查。结果发现，与阴性对照组（未治疗）相比，REBA-NS组的泪液分泌量总体减少，荧光素染色增加。

结论
成功开发了一种含有原位凝胶（REBA-NS凝胶）的rebamipide纳米悬浮液，用于治疗DED。REBA-NS具有纳米颗粒、高药物含量、持续药物释放、溶解度提高和非细胞毒性。此外，使用吉兰胶制备了REBA-NS的原位凝胶，便于局部应用。REBA-NS凝胶具有透明且无菌的性质、高药物含量、持续药物释放和黏附性。