一种新型的TIM-3循环肽拮抗剂，通过重新激活耗竭的T细胞活性用于癌症免疫治疗

《European Journal of Pharmacology》：A novel cyclic-peptide antagonist of TIM-3 for cancer immunotherapy by reinvigorating exhausted T-cell activity

　　

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  通过基于细菌表面展示的新型CX₁₂C环肽展示库，筛选出一种能与TIM-3和TBP1结合的环肽。
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  TBP1有效破坏了TIM-3与CEACAM-1和PtdSer的相互作用。
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  TBP1在体外条件下恢复了耗竭T细胞的功能。
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  TBP1与抗PD-1抗体协同作用，在体内增强了抗肿瘤免疫。

引言

癌症免疫疗法作为一种旨在恢复或增强宿主抗肿瘤免疫的创新方法，已经彻底改变了癌症的治疗方式（Emens等人，2016年；Mellman等人，2011年）。T细胞在肿瘤特异性免疫反应中起着核心作用（Pardoll，2012年），但时常受到免疫检查点如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）和PD-1的抑制，而肿瘤会利用这些检查点来逃避免疫系统（Zhao和Subramanian，2018年）。基于此，免疫检查点抑制剂（ICIs），特别是抗PD-1/PD-L1单克隆抗体（mAbs），在多种癌症类型中取得了显著的临床疗效（Han等人，2020年；Lee等人，2022年）。然而，在许多情况下，例如结直肠癌和胃癌，客观反应率（ORR）和总体疗效仍然不令人满意（Zhao和Subramanian，2017年），这表明其他检查点途径可能在免疫逃逸中起主导作用（Das等人，2017年）。

T细胞耗竭是一种常见的现象，在实体瘤中尤为普遍（Thommen等人，2015年；Wherry和Kurachi，2015年）。耗竭的T细胞（T_EX）会同时表达多种抑制性分子，如PD-1、TIM-3和淋巴细胞激活基因3（LAG-3）等（Datar等人，2019年；Harjunp??和Guillerey，2020年）。TIM-3和PD-1的共同表达标志着实体瘤中最为耗竭的T细胞群体（Fourcade等人，2010年；Ngiow等人，2011年；Sakuishi等人，2010年），这表明单用抗PD1/PD-L1疗法可能不足以恢复T细胞的活性。此外，TIM-3的上调会增强对PD-1阻断的抵抗力（Koyama等人，2016年；Shayan等人，2017年）。这些数据表明，双重阻断TIM-3和PD-1可能更有效地恢复T细胞功能，从而推动了TIM-3抑制剂的发展。

TIM-3最初被鉴定为干扰素-γ（IFN-γ）生成的CD4⁺辅助T细胞1型（Th1）和CD8⁺细胞毒性T细胞（CTLs）的负调节因子（Monney等人，2002年；Wolf等人，2020年），同时也表达在自然杀伤细胞（NK细胞）、树突状细胞（DCs）和调节性T细胞（Tregs）上（Zhu等人，2011年）。已鉴定出四种配体：CEACAM-1、PtdSer和高迁移率族箱-1（HMGB-1）可以与IgV结构域中的FG和CC’环形成的口袋结合，而半乳糖凝集素-9（Gal-9）则识别另一侧的N连接糖链（Cao等人，2007年；Huang等人，2015年；Santiago等人，2007年）。与CEACAM-1的结合会触发TIM-3胞质域中Tyr256和Tyr263的磷酸化，导致HLA-B相关转录本3（BAT3）的释放，并招募激酶FYN1，进而引发下游磷酸酶活性以抑制T细胞受体信号传导。Gal-9可能诱导CD4⁺ Th1细胞的迟钝反应和凋亡（Wolf等人，2020年）。从凋亡的肿瘤细胞中释放的PtdSer主要与TIM-3⁺ DCs相互作用，促进肿瘤抗原的交叉呈递，从而引发免疫耐受（Santiago等人，2007年）。HMGB-1可以与死亡肿瘤细胞释放的核酸结合，随后与TIM-3⁺ DCs相互作用，减弱先天免疫的激活（Chiba等人，2012年）。值得注意的是，具有体内疗效的小鼠和人类TIM-3抑制剂已被证明能够阻断CEACAM-1和PtdSer与TIM-3的结合，为治疗开发提供了重要线索（Sabatos-Peyton等人，2018年）。

迄今为止，至少有二十种抗TIM-3抗体，包括MBG453、TQB2618、TSR-022、AZD7789等，已进入临床试验（注册链接：ClinicalTrials.gov），用于治疗实体瘤患者（Curigliano等人，2021年；Mei等人，2023年）。总体而言，单用TIM-3抑制剂的疗效有限。TIM-3抑制剂与PD-1/PD-L1抑制剂联合使用时可观察到部分早期反应（大约10%～40%）（Mei等人，2023年）。然而，基于抗体的ICIs常常伴随着免疫相关不良事件（irAEs）、有限的肿瘤穿透能力和高昂的生产成本（Duong等人，2024年；Moslehi等人，2018年）。肽类由于其较小的分子大小、较低的免疫原性和易于制造的特点，提供了一种有吸引力的替代方案。虽然小分子抑制剂难以破坏大型蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）界面，但肽类可以实现高特异性和效力（Moslehi等人，2018年）。已有几种肽类被报道能够阻断PD-1/PD-L1相互作用（Chang等人，2015年；Fosgerau和Hoffmann，2015年）。特别是环肽，表现出增强的结构稳定性、抗蛋白水解性和延长的半衰期，使其成为有前景的治疗候选分子（Zhong等人，2020年）。有研究表明，一种用于阻断PD-1/PD-L1通路的大环肽在恢复T细胞功能方面与抗体相当（Zorzi等人，2017年）。一种通过噬菌体展示筛选得到的二硫键环肽“CVPMTYRAC”能够增强肿瘤抗原特异性CD8⁺ T细胞反应（Magiera-Mularz等人，2017年）。因此，开发TIM-3的环肽拮抗剂作为抗体的替代品非常具有吸引力，因为它们具有相似的疗效和更好的安全性。

在这项研究中，通过构建细菌表面展示库（Gurung等人，2020年；Zhai等人，2020年），鉴定出一种能够特异性结合TIM-3的新型二硫键环肽，该肽能有效破坏TIM-3与配体CEACAM-1和PtdSer的相互作用。体外和体内实验表明，这种肽可以恢复T细胞活性，并与抗PD-1 mAb协同作用，从而增强肿瘤抑制效果。这些发现支持了TIM-3靶向环肽的治疗潜力，并强调了它们作为免疫检查点调节剂在联合癌症免疫疗法中的可行性。

章节摘要

细胞系和细胞培养

通过慢病毒载体感染CHO-K1细胞（中国苏州iCarTab Biotechnology Co., Ltd.提供的中国仓鼠卵巢细胞亚克隆），生成了过表达TIM-3的CHO-K1细胞系（CHO-K1-TIM3）。CHO-K1-TIM3和CHO-K1在含有10% FBS（Gibco，美国）和1% Pen Strep（Gibco，美国）的Hams F-12K培养基中培养，而CHO-K1-TIM3的培养基还需要添加2 μg/mL的嘌呤霉素（Beyotime Biotechnology，中国）。A549细胞

从CX₁₂C细菌库中筛选结合TIM-3的环肽

成功构建了一个细菌表面展示的环肽库（CX12C），其质粒设计的示意图见图S1A。根据从LB-琼脂平板上获得的菌落数量估计，该库的多样性约为5×10⁶个独立克隆（Qin等人，2023年）。对随机选取的克隆进行DNA测序，证实了多种肽编码序列已成功插入到大肠杆菌（E. coli）的eCPX支架中（图S1B）。这些

讨论

在本研究中，我们构建了一个新型的CX12C环肽展示库，并成功鉴定出一种新的TIM-3结合环肽TBP1。TBP1既与人TIM-3也与小鼠TIM-3发生交叉反应，并能有效破坏TIM-3与其配体CEACAM-1和PtdSer之间的相互作用。在体外实验中，TBP1恢复了TIM-3/CEACAM-1介导的T细胞耗竭。在体内实验中，TBP1与抗PD-1抗体协同作用，增强了肿瘤抑制效果。

CRediT作者贡献声明

Ying Huang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿编写，数据可视化，方法学研究，数据整理。Jiale Li：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿编写，数据可视化，方法学研究，数据整理。Yingzhou Qin：方法学研究，数据分析。Bo Qie：方法学研究，数据分析。Qianqian Wang：方法学研究。Cuijuan Liu：数据分析。Yimin Zhu：方法学研究，资金筹集，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了苏州科学技术局的支持（编号：SS2019013）。

Ying Huang|Jiale Li|Yingzhou Qin|Bo Qie|Qianqian Wang|Cuijuan Liu|Yimin Zhu