《Experimental Eye Research》：Influence of Riboflavin-UV-A illumination on the Expression of pro- and anti-apoptotic Markers in Human Corneal Fibroblasts from Healthy and Keratoconus Corneas
编辑推荐：
•核黄素与紫外线A（UV-A）照射在健康的人类角膜成纤维细胞以及来自圆锥角膜（keratoconus）的人类角膜成纤维细胞中引发了时间与剂量依赖性的细胞反应。•来自圆锥角膜的人类角膜成纤维细胞对光化应激的凋亡敏感性高于健康的人类角膜成纤维细胞。•核黄素与UV-A照射能够迅速抑制健
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核黄素与紫外线A（UV-A）照射在健康的人类角膜成纤维细胞以及来自圆锥角膜（keratoconus）的人类角膜成纤维细胞中引发了时间与剂量依赖性的细胞反应。
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来自圆锥角膜的人类角膜成纤维细胞对光化应激的凋亡敏感性高于健康的人类角膜成纤维细胞。
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核黄素与UV-A照射能够迅速抑制健康的人类角膜成纤维细胞以及来自圆锥角膜的人类角膜成纤维细胞的增殖。
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透射电子显微镜观察显示，核黄素与UV-A照射后细胞发生了超微结构变化。
引言
圆锥角膜（Keratoconus，KC）是一种进行性、通常为双侧且不对称的角膜疾病，与透明边缘变性（pellucid marginal degeneration）和角膜球状变性（keratoglobus）一起，被归类为角膜扩张性病变。其特征是角膜基质变薄，这种变薄通常发生在中央附近，尤其在颞下象限最为明显（Li等人，2008年）。
针对不同阶段病情的治疗对于圆锥角膜的管理至关重要。保守的治疗方法包括佩戴眼镜和硬性透气隐形眼镜。微创介入方法包括核黄素与紫外线A（UV-A）交联（CXL）以及植入角膜基质内环段（ICRS）。更具侵入性的外科治疗方法包括深层前板层角膜移植术（Deep Anterior Lamellar Keratoplasty，DALK）和穿透性角膜移植术（Penetrating Keratoplasty，PK）（Gomes等人，2015年）。CXL通过涉及光敏剂核黄素（维生素B2）和UV-A照射的光化学反应产生额外的化学键来增强和稳定角膜（Wollensak等人，2003年）。尽管该技术已被广泛使用，但过去几十年的各种组织学研究表明，经过治疗的角膜中存在长期的、有时甚至是永久性的角膜细胞损伤，这可能是由活性氧物种（Reactive Oxygen Species，ROS）引发的凋亡过程所导致的（Messmer等人，2013年；Raiskup和Spoerl，2013年）。
凋亡现象最早由Kerr、Wyllie和Currie在1972年描述，是一种由外部或内部刺激引发的程序性细胞死亡过程（Kerr等人，1972年）。凋亡细胞的典型超微结构变化包括细胞质和染色质的浓缩（新月形核）、核和细胞质的聚集、核碎裂、高尔基体位移、膜起泡，最终形成凋亡小体，这些凋亡小体会被巨噬细胞清除（Kerr等人，1972年；Snigirevskaya和Komissarchik，2019年）。
凋亡主要通过两条途径发生：内在途径和外在途径，这两条途径最终汇聚于同一个终点（图1）。内在途径由多种细胞内信号触发，包括生长因子或激素的撤回（负信号），或暴露于辐射、毒素、ROS或病毒感染（正信号）（Wei等人，2001年）。
这些刺激通过B细胞淋巴瘤2（BCL-2）家族蛋白的作用促使线粒体外膜通透化（Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization，MOMP）。促凋亡因子如BCL-2拮抗剂/杀伤蛋白1（BAK）和BCL-2相关X蛋白（BAX）协调线粒体外膜的通透化过程，而抗凋亡因子如BCL-2和BCL-XL则抑制这一过程（Ho?ota和Posmyk，2025年；Lalier等人，2022年；Siddiqui等人，2015年；Singh等人，2019年）。凋亡抑制蛋白家族（Apoptosis Inhibitor Protein family，IAP）的成员包括BIRC5（survivin；含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质5），它可以通过直接结合效应性半胱天冬酶来抑制它们（Johnson和Howerth，2004年）。最重要的促凋亡介质之一是细胞色素c（Cytochrome c，CYCS），它与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）/前体半胱天冬酶-9（Procaspase-9）结合形成凋亡小体（Lossi，2022年；Ow等人，2008年）。凋亡小体随后激活前体半胱天冬酶-9（Procaspase-9），进而激活效应性半胱天冬酶Caspase-3（CASP3）和Caspase-7（CASP7），从而完成凋亡过程的最后阶段（Elmore，2007年）。外在途径则通过配体与跨膜死亡受体（如Fas受体Fas-R和肿瘤坏死因子受体1 TNFR1）结合来启动，导致促凋亡适配蛋白的募集，形成死亡诱导信号复合体（Death-Inducing Signal Complex，DISC），进而激活Caspase-8（CASP8）（Lossi，2022年）。通过CASP8，内在凋亡途径被激活，从而导致线粒体外膜通透化并释放CYCS（Moldoveanu等人，2013年）。凋亡的最后阶段由Caspase-3执行，它切割脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA），暴露磷酸脂丝氨酸，并形成凋亡小体以供巨噬细胞清除（Lossi，2022年；Segawa和Nagata，2015年）。
由于CXL与凋亡密切相关，本研究旨在通过多种细胞生物学分析，比较未经处理和经过处理的健康人类角膜成纤维细胞（HCF）以及来自圆锥角膜的人类角膜成纤维细胞（KC-HCF）在核黄素与UV-A照射下的基因和蛋白质表达差异，重点关注促凋亡和抗凋亡标记物。
章节摘录
人类角膜组织和伦理批准
临床确诊为圆锥角膜的患者的角膜组织是在选择性穿透性角膜移植术（Elective Penetrating Keratoplasty，PK）过程中获取的。所有患者在手术前均签署了书面知情同意书，同意将其角膜组织用于研究目的。健康的对照角膜组织由Trier/Westpfalz地区的LIONS Cornea Bank Saar-Lor-Lux提供，这些组织来自已故捐赠者。使用15毫米钻头在无菌条件下获取角膜组织。
结果
0.01%和0.1%的核黄素溶液处理后，再结合UV-A照射，HCF和KC-HCF的增殖在2小时后均显著下降（图2）。与对照组相比，0.01%核黄素处理后的HCF增殖显著降低（p=0.014），0.1%核黄素处理后的HCF增殖也显著降低（p=0.017）。KC-HCF在核黄素与UV-A照射后同样表现出显著的增殖抑制。
讨论
自Spoerl等人在1998年引入CXL技术以来，该技术已成为圆锥角膜适当阶段治疗的常规手段（Seitz等人，2021年；Spoerl等人，1998年）。研究表明，UV-A照射会导致治疗过的角膜中的角膜细胞长时间甚至永久性的损伤（Mencucci等人，2010年；Messmer等人，2013年；Wollensak等人，2003年）。在这种情况下，使用光敏剂核黄素和UV-A治疗进行性圆锥角膜的有效性仍不明确。
结论
本研究表明，核黄素与UV-A照射在HCF和KC-HCF中均能以剂量依赖的方式诱导凋亡，且KC-HCF似乎对光化应激更为敏感。2小时后细胞增殖显著减少，结合基因和蛋白质表达分析的结果，可能表明凋亡信号通路已被激活。透射电子显微镜观察显示，核黄素与UV-A照射后细胞发生了明显的超微结构变化。
作者贡献声明
Julian Kahlert：撰写初稿、可视化处理、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。Ning Chai：撰写、审稿与编辑、方法设计。Frank Schmitz：撰写、审稿与编辑、实验实施。Shweta Suiwal：撰写、审稿与编辑、实验实施、数据分析。Tim Berger：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。
伦理声明
所有参与者或其法定代理人均已签署书面同意书，同意参与本研究并发表相关文章。参与者的隐私权得到了充分尊重。
本研究涉及器官或组织捐赠者。所使用的样本均获得了捐赠者或其亲属或法定代理人的同意，同意将其用于本研究及文章发表。
本研究已获得萨尔兰医学协会（Medical Association of Saarland）伦理委员会的批准（伦理批准编号54/23），并遵循《赫尔辛基宣言》（Declaration of Helsinki）进行。确诊为圆锥角膜的患者在接受选择性穿透性角膜移植术前已签署书面同意书，同意将其角膜组织用于研究目的。健康的角膜组织由Trier/Westpfalz地区的LIONS Cornea Bank Saar-Lor-Lux提供。
作者声明没有利益冲突。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
Julian Kahlert|Maximilian Berger|Berthold Seitz|Ning Chai|Shweta Suiwal|Nóra Szentmáry|Frank Schmitz|Tim Berger
