《Experimental and Molecular Pathology》：Identification of OTUD7a downregulation and global ubiquitination remodeling in a murine asthma model
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摘要
气道上皮功能障碍是哮喘的一个标志性特征，参与慢性炎症和结构重塑。近期研究提示翻译后修饰在调节上皮免疫反应中发挥作用。然而，特异性去泛素化酶（deubiquitinating enzymes, DUBs）的作用仍不清楚。在本研究中，研究人员在一个过敏性哮喘
摘要
气道上皮功能障碍是哮喘的一个标志性特征，参与慢性炎症和结构重塑。近期研究提示翻译后修饰在调节上皮免疫反应中发挥作用。然而，特异性去泛素化酶（deubiquitinating enzymes, DUBs）的作用仍不清楚。在本研究中，研究人员在一个过敏性哮喘小鼠模型中鉴定出OTU去泛素化酶7a（OTUD7a）是一个显著下调的基因。两个独立数据集（GSE71822和GSE9383）的转录组学分析一致揭示哮喘肺组织中OTUD7a的表达受到抑制。此外，免疫荧光分析表明，OTUD7a在CC10阳性的细支气管上皮细胞中被检测到，这类非纤毛上皮细胞以其抗炎功能而著称。为探索OTUD7a的分子关联，研究人员建立了过表达Flag标签标记的OTUD7a的club细胞系，并进行免疫共沉淀-质谱（co-immunoprecipitation–mass spectrometry, Co-IP/MS）分析。研究人员鉴定出1135个候选相互作用蛋白。与此同时，基于液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）的泛素化组学分析（ubiquitinome profiling）在卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导的哮喘肺组织中揭示了广泛的蛋白质泛素化变化，超过3000个差异性修饰的泛素化位点。这些变化富集在与免疫信号、细胞骨架动力学和上皮屏障功能相关的通路中。综上所述，研究人员的发现表明，作为一种在CC10阳性细支气管上皮细胞中检测到的DUB，OTUD7a在哮喘中显著减少，并呈现了过敏性气道炎症中泛素化变化的全面图谱。因此，该研究为哮喘发病机制中的翻译后调控提供了新的见解。
**OTUD7a在哮喘发病机制中的作用：从转录组筛选到泛素化组学图谱的整合解读**
**1. 研究背景与科学问题**
哮喘是一种以气道高反应性（airway hyperresponsiveness, AHR）、可逆性气流阻塞和持续性炎症为特征的慢性气道炎症性疾病。尽管在阐明哮喘的免疫病理机制方面已取得显著进展，但气道上皮功能障碍和气道重塑背后的细胞与分子因素仍不明确。近年来，越来越多的证据表明气道上皮不仅仅是被动屏障，还主动参与免疫调节，包括细胞因子产生、抗原呈递和白细胞募集。在肺内多种上皮细胞群体中，主要位于细支气管上皮的club细胞（旧称Clara细胞）在维持上皮稳态、外源物解毒和免疫反应调节中发挥关键作用，这些细胞分泌club细胞分泌蛋白（club cell secretory protein, CC10），一种在哮喘中常被下调的抗炎介质。近期研究发现，翻译后修饰（尤其是泛素化）已成为上皮信号传导和免疫稳态的重要调节机制。泛素化通过E1、E2、E3酶级联反应将泛素连接到底物蛋白的赖氨酸残基上，影响蛋白质的稳定性、转运和功能，并受去泛素化酶（deubiquitinating enzymes, DUBs）动态平衡调控。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）的失调参与多种呼吸系统疾病，但单个DUB在哮喘中的功能意义仍知之甚少。OTUD7a是含OTU结构域的DUB家族成员，对K11连接的多聚泛素链具有特异性，既往研究涉及其在神经发育过程中的作用，但在呼吸系统中的表达谱、细胞分布和潜在作用尚未阐明。基于此，研究人员开展了本研究，以探讨OTUD7a在卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导的哮喘小鼠肺组织中的表达及其分子关联，并绘制过敏性气道炎症中蛋白质泛素化的整体图谱。
**2. 主要技术方法概述**
研究人员利用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）中两个独立的小鼠哮喘模型转录组数据集（GSE71822和GSE9383），通过R语言limma包进行差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析，并采用韦恩分析取交集。动物实验使用雌性BALB/c小鼠，通过OVA腹腔注射致敏联合鼻内滴注激发构建过敏性哮喘模型，并通过肺功能检测、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）细胞计数、苏木精-伊红（H&E）染色、过碘酸-雪夫（periodic acid-Schiff, PAS）染色和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）验证模型。为鉴定OTUD7a相互作用蛋白，研究人员构建了Flag标签标记的OTUD7a过表达慢病毒，感染小鼠肺club细胞系C22后，进行免疫共沉淀-质谱（co-immunoprecipitation-mass spectrometry, Co-IP/MS）分析。同时，利用LC–MS/MS对OVA诱导的哮喘肺组织进行基于K-ε-GG剩余基序富集的泛素化组学分析，并借助FragPipe、Perseus等软件进行数据处理和生物信息学分析。此外，还采用了免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blot）、反向免疫共沉淀和分子对接分析。
**3. 主要研究结果**
*3.1. GEO数据集转录组分析鉴定出哮喘中共同下调基因Otud7a*
通过对GSE71822（含10个尘螨（house dust mite, HDM）诱导哮喘样本和6个对照样本）和GSE9383（含4个OVA诱导哮喘样本和4个对照样本）进行差异表达分析，热图和火山图展示了显著差异表达基因的分布。韦恩分析显示，两个数据集中共同下调的基因有3个：Otud7a、Pde10a和Uroc1。由于本研究聚焦于泛素化和去泛素化在哮喘中的潜在作用，且OTUD7a编码去泛素化酶，研究人员选择OTUD7a进行后续深入研究。
*3.2. OVA诱导哮喘模型的成功建立与OTUD7a表达下调的验证*
OVA激发的小鼠表现出显著的支气管周围和血管周围炎症细胞浸润，肺部炎症评分升高；PAS染色显示黏液产生增多和杯状细胞增生，PAS评分增加；OVA激发还显著增加了小鼠对乙酰甲胆碱的气道阻力和血清OVA特异性IgE水平；BALF中总炎症细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞计数均增加，证实了哮喘模型的成功建立。Western blot和免疫荧光定量分析均显示，OVA处理的肺组织中OTUD7a表达较对照组显著降低。
*3.3. OTUD7a定位于CC10阳性细支气管上皮细胞*
免疫荧光共染色结果显示，OTUD7a在肺上皮区域和CC10阳性的细支气管上皮细胞中被检测到，而OVA处理的肺组织中OTUD7a平均荧光强度降低。在C22细胞系中同样观察到了OTUD7a与CC10的共染色，进一步支持了OTUD7a在club细胞中的定位。
*3.4. Co-IP/MS鉴定出1135个候选OTUD7a相关蛋白*
通过慢病毒转导构建稳定过表达Flag-OTUD7a的C22 club细胞系，Co-IP/MS分析共鉴定出1135个候选OTUD7a相关蛋白。基于光谱计数、序列覆盖率和-10logP值排名了前20个候选蛋白。基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析展示了这些蛋白参与的生物学过程和信号通路。研究人员指出，这些结果提示潜在的物理关联，但仍需额外的Co-IP验证以确认是否为内源性OTUD7a的相关蛋白。
*3.5. 泛素化组学揭示OVA诱导哮喘肺组织中广泛的泛素化重塑*
LC–MS/MS泛素化组学分析中，主成分分析和偏最小二乘判别分析均显示OVA组与对照组存在明显分离，表明整体泛素化模式存在显著差异。与对照组相比，OVA组中有2053个泛素化位点和1224个泛素化蛋白显著上调。功能注释分析显示，信号转导机制是差异泛素化蛋白中最富集的类别；KEGG、Reactome和GO富集分析突出了与免疫应答、细胞内信号传导和细胞骨架调节相关的通路；蛋白质家族（Protein Families database, Pfam）结构域富集分析列出了前20个显著改变的蛋白质结构域；亚细胞定位预测显示差异泛素化蛋白主要定位于细胞质。研究人员强调，虽然OTUD7a下调可能与泛素化稳态改变相关，但该泛素化组分析反映的是全肺蛋白质组的整体变化，不应被解释为这些泛素化事件直接受OTUD7a调控的证据。
*3.6. TRIM21被鉴定为候选OTUD7a相关蛋白*
在Co-IP/MS鉴定的候选蛋白中，研究人员选择TRIM21（RING型E3泛素转移酶）进行进一步验证。反向免疫共沉淀实验表明，使用抗TRIM21抗体能够富集OTUD7a，为两者的关联提供了实验证据。分子对接分析预测了OTUD7a与TRIM21之间潜在的结合界面，为它们的潜在相互作用提供了计算支持。
**4. 讨论与结论**
研究人员指出，既往研究已广泛涉及UPS在慢性肺部疾病中的作用，但对特定DUB在哮喘中的研究仍然稀少。OTUD7a既往在神经发育和蛋白酶体生物发生背景下被表征，其在肺部病理生理学中的作用尚未被探索。本研究通过揭示OTUD7a在CC10阳性细支气管上皮细胞中的定位及其在过敏性气道疾病中的下调，拓展了现有认知。一个值得注意的观察是，OTUD7a表达显著降低而哮喘肺组织中整体蛋白质泛素化广泛增加。尽管增加的泛素化与降低的去泛素化活性大体相容，但这种关系应谨慎解读，因为泛素化组分析捕获的是全肺组织的整体泛素化变化，未区分特异性泛素连接类型，而OTUD7a是K11优先的去泛素化酶且仅存在于CC10阳性细支气管上皮细胞中。因此，观察到的泛素化重塑不能直接归因于OTUD7a下调，而可能受多种因素影响。
该研究存在以下局限性：Co-IP/MS分析基于Flag标签标记的OTUD7a过表达以提高低丰度蛋白复合物的富集效率，可能引入非生理性或亲和力偏倚的相互作用，因此所鉴定的蛋白应被视为候选OTUD7a相关蛋白；泛素化组分析未区分包括K11连接在内的特异性泛素连接类型，也未确定改变的泛素化事件是否为OTUD7a的直接底物；缺乏OTUD7a的功能获得、功能缺失或回补实验，OTUD7a表达减少是否直接导致OVA诱导的表型尚未得到验证；OTUD7a的定位评估主要通过与CC10共染色完成，未系统检查其在其他肺上皮亚型（如纤毛细胞、基底细胞或杯状细胞）中的分布；近年研究强调成纤维细胞在气道炎症和重塑中的作用，OTUD7a介导的泛素化信号是否也参与成纤维细胞功能有待研究；此外，整合转录组分析中鉴定出的另外两个共同下调基因Pde10a和Uroc1在过敏性气道炎症中的潜在作用有待后续研究。
结论：本研究整合小鼠哮喘模型、蛋白质组学分析和基于细胞的分析，探讨了OTUD7a在过敏性气道炎症中的潜在参与，并评估了哮喘肺组织中发生的整体泛素化变化。研究结果为OTUD7a表达和该模型中泛素化重塑提供了新的见解，并可能为过敏性气道炎症中泛素化相关机制的后续研究提供参考。该论文发表于《Experimental and Molecular Pathology》。
