GRASP：一种不依赖于植物转化的基于CRISPR的系统，用于特异性染色质位点的亲和纯化

《Horticulture Research》：GRASP: a plant transformation-independent CRISPR-based system for affinity purification of specific chromatin loci

　　

摘要

染色质结构通过控制DNA对转录因子和调控复合物的的可访问性来调控基因组的稳定性和基因表达。DNA与蛋白质的相互作用通常通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术进行研究，该方法依赖于特定的抗体和技术要求较高的实验流程。CRISPR-Cas技术利用催化活性较低的Cas9（dCas9）实现对基因组位点的序列特异性靶向，但大多数基于CRISPR的染色质捕获方法在植物中需要短暂或永久性的转化，这限制了它们在不同物种、组织和环境条件下的应用。在这里，我们介绍了一种名为GRASP（通过CRISPR纯化实现基因组区域亲和捕获）的方法，这是一种无需转化即可直接从纯化的植物细胞核中分离特定序列染色质的策略。在GRASP过程中，dCas9与引导RNA组成的核糖核蛋白复合物在体外组装，并用于从经过超声处理的染色质中捕获预定义的基因组区域，从而绕过了转基因表达的步骤。以葡萄（Vitis vinifera）和番茄（Solanum lycopersicum）为模型系统，我们通过体外实验和CRISPR-FISH验证了dCas9对端粒重复序列的结合能力。亲和纯化流程可应用于端粒区域、低拷贝数和单拷贝数基因位点，其富集程度通过qPCR和下一代测序技术进行检测。除了DNA分离之外，GRASP还为下游分析提供了丰富的平台，可用于研究与这些位点相关的染色质成分，包括蛋白质复合物、远端DNA相互作用以及染色质相关RNA。