血管紧张素II驱动的TGF-β1上调血小板PAR4表达并增强高血压血栓形成风险

《European Heart Journal》：Angiotensin II-driven TGF-β1 increases platelet PAR4 expression enhancing thrombotic risk in hypertension

　　

背景与目的：高血压患者表现出对促血栓形成状态的高度易感性，从而增加其心血管事件风险。G蛋白偶联受体（GPCRs）是血小板功能的核心介质；然而，GPCRs导致血小板高反应性的机制尚不清楚。本研究探讨蛋白酶激活受体4（PAR4）在高血压血小板过度激活中的作用。
方法：采用RNA测序（RNA-seq）和流式细胞术分析150例高血压患者、自发性高血压大鼠（SHRs）及L-NAME诱导的高血压小鼠的血小板GPCR表达。通过体内及离体血栓模型和体外血小板功能研究评估PAR4过表达对血小板活化的影响，并利用PAR4缺陷小鼠进行验证。应用巨核细胞和转化生长因子β1（TGF-β1）缺陷小鼠研究PAR4的转录调控机制。
结果：高血压患者血小板中PAR4表达升高，且与整合素αⅡbβ3活化和P-选择素暴露呈正相关，该发现在SHRs和高血压小鼠中得到验证。PAR4过表达通过PAR4的Gq和G12/13信号通路增强凝血酶和AYPGKF诱导的血小板活化，但不增强SFLLRN诱导的PAR1介导的血小板活化，从而驱动动脉血栓形成。利用TGF-β1缺陷小鼠的机制研究确定，TGF-β1激活转录因子Smad2，使其与PAR4启动子结合并上调PAR4转录。血管紧张素II启动TGF-β1/Smad2信号传导，而血管紧张素II受体阻滞剂（ARB）缬沙坦可降低PAR4表达，从而减轻高血压状态下的血栓形成。
结论：血管紧张素II驱动的TGF-β1上调血小板PAR4转录，从而增强高血压状态下的血小板活化。缬沙坦可逆转血小板PAR4过表达以抑制血栓形成，揭示了ARBs在高血压中一种新的多效性抗血栓药理机制。

**论文解读：血管紧张素II驱动的TGF-β1信号通路上调血小板PAR4表达增强高血压血栓形成风险**

**一、研究背景与研究目的**

高血压是缺血性心脏病和脑卒中等血栓性心血管事件的首要危险因素，血小板功能亢进是其核心病理环节之一。尽管目前临床广泛采用阿司匹林和氯吡格雷等抗血小板药物防治高血压相关心血管并发症，但血栓事件的发生率仍居高不下，提示现有抗血小板策略在高血压人群中存在局限性。因此，深入阐明高血压状态下血小板高反应性的分子机制，对于优化防治策略具有重要意义。

血小板活化受多种G蛋白偶联受体（G蛋白偶联受体，GPCRs）调控，其中蛋白酶激活受体4（蛋白酶激活受体4，PAR4）作为凝血酶受体，在血小板激活和血栓形成中发挥关键作用。既往研究表明，编码PAR4的F2RL3基因存在多个与血小板高反应性相关的单核苷酸多态性（单核苷酸多态性，SNPs），且这些多态性可增加缺血性脑卒中的易感性。然而，血小板PAR4是否存在转录水平的表达异常及其在高血压血栓形成中的作用机制，尚不清楚。

转化生长因子β1（转化生长因子β1，TGF-β1）/SMAD家族成员2（SMAD家族成员2，Smad2）信号通路是高血压相关心血管并发症的重要介质，但其能否直接调控血小板基因转录以增强动脉血栓形成，此前未见报道。基于此，研究人员开展了本研究，旨在探讨PAR4在高血压血小板过度激活中的作用及其上游转录调控机制，并评估血管紧张素II受体阻滞剂（血管紧张素II受体阻滞剂，ARB）的潜在抗血栓获益。

**二、主要技术方法**

本研究属于探索性基础研究。研究人员首先依托150例高血压患者和150例血压正常健康对照者组成的队列，以及自发性高血压大鼠（自发性高血压大鼠，SHRs）和L-NAME诱导的高血压小鼠模型，综合运用RNA测序（RNA-seq）、实时荧光定量PCR（qPCR）、流式细胞术和免疫印迹等检测血小板GPCR表达谱。利用体内FeCl?诱导血栓模型（肠系膜小动脉、颈动脉及腹主动脉）、离体微流控全血灌流装置和体外血小板功能实验（聚集、ATP释放、铺展、血块回缩、钙内流）评估PAR4过表达对血小板活化及血栓形成的促进作用。PAR4缺陷（PAR4?/?）小鼠及血小板特异性TGF-β1缺陷（TGF-β1?/?）小鼠用于验证PAR4依赖性和解析转录调控机制。巨核细胞系Meg-01细胞用于分子机制研究，包括Smad2激动剂/过表达处理、TGF-β1刺激及抑制剂干预、双荧光素酶报告基因和电泳迁移率变动实验（电泳迁移率变动实验，EMSA）鉴定Smad2与PAR4启动子的结合位点。此外，研究人员对10例高PAR4表达的高血压患者给予缬沙坦（80 mg/日）治疗7天，动态监测PAR4表达和血小板功能变化。

**三、主要研究结果**

**1. 高血压患者血小板PAR4表达增加**

RNA-seq筛选发现，高血压患者和SHRs血小板存在20个共同异常表达的GPCR，其中F2RL3（编码PAR4）在高血压患者中转录上调最为显著。qPCR和流式细胞术在150例高血压患者中验证了PAR4 mRNA和蛋白水平较健康对照升高2.2倍，而PAR1表达无差异。相关性分析显示，PAR4表达水平与整合素αⅡbβ3活化（r = 0.4362, P < .001）及P-选择素暴露（r = 0.2988, P < .001）呈正相关。在ST段抬高型心肌梗死（ST段抬高型心肌梗死，STEMI）患者的冠状动脉血栓标本中，高血压患者的血小板PAR4沉积和PAR4?CD41?/CD41?比例显著高于非高血压患者。

**2. PAR4表达增加增强高血压患者血小板活化**

将150例高血压患者按PAR4表达水平分为高表达组和低表达组（各10例）。高PAR4组患者对凝血酶和PAR4特异性激动剂AYPGKF诱导的血小板聚集、ATP释放、PF4和5-羟色胺分泌、整合素αⅡbβ3活化和P-选择素暴露均显著增强，而PAR1激动剂SFLLRN诱导的反应两组无差异。PAR4拮抗剂BMS-986120可消除高PAR4组的增强效应，包括血小板聚集、铺展、血块回缩和微流控通道内血栓形成。

**3. 高血压小鼠中PAR4依赖性血小板高反应性与血栓形成**

L-NAME诱导的高血压小鼠在8周处理期间，血小板PAR4表达时间依赖性升高，凝血酶和AYPGKF诱导的血小板聚集同步增强，且与PAR4表达水平正相关。体内FeCl?诱导血栓模型中，高血压PAR4f/f小鼠血栓形成加速，而PAR4?/?小鼠在L-NAME诱导高血压后血栓形成无明显变化；BMS-986120可消除高血压小鼠的血栓形成增强效应。离体微流控实验结果与体内一致。

**4. 高血压状态下PAR4下游Gq和G12/13信号增强**

在高PAR4表达的高血压患者血小板中，凝血酶和AYPGKF刺激下磷脂酶Cβ3（PLCβ3）磷酸化、蛋白激酶C（PKC）磷酸化、钙离子内流（Gq通路）以及RhoA和肌球蛋白轻链2（MLC）磷酸化（G12/13通路）均显著增强，而SFLLRN刺激下上述信号无差异。SHRs和高血压小鼠血小板中同样观察到PAR4而非PAR3依赖的Gq和G12/13信号增强。

**5. TGF-β1/Smad2信号通路上调高血压血小板PAR4表达**

RNA-seq筛选共同差异表达转录因子，Smad2在SHRs中显著上调。Smad2转录活性在高血压患者、SHRs和高血压小鼠血小板中均升高。在Meg-01细胞中，Smad2激动剂mAAPV和Smad2过表达均可时间依赖性增加PAR4表达；重组TGF-β1可诱导Smad2磷酸化并上调PAR4，而TGF-β1抑制剂fresolimumab和Smad2抑制剂SIS3可阻断该效应。血小板特异性TGF-β1缺陷小鼠在L-NAME诱导高血压后Smad2磷酸化和PAR4表达无升高，AYPGKF诱导的血小板聚集也无增强。启动子分析结合双荧光素酶报告基因和EMSA证实，TGF-β1激活的Smad2可直接结合PAR4基因启动子上的2个功能性结合位点（位点2和位点3）并促进转录。

**6. Ang II激活TGF-β1/Smad2信号上调Meg-01细胞PAR4表达**

Ang II以浓度依赖性方式（100–1500 ng/L，相当于高血压患者病理范围）增加Meg-01细胞中TGF-β1表达、Smad2磷酸化和PAR4表达。血管紧张素II 1型受体拮抗剂FK-739、fresolimumab、SIS3及Smad2 siRNA均可逆转Ang II的作用。ELISA检测显示高血压患者血浆Ang II和TGF-β1水平升高，且血浆Ang II水平与血小板PAR4表达呈正相关（r = 0.4362）。

**7. 缬沙坦逆转PAR4过表达抑制血小板活化和血栓形成**

10例高PAR4表达的高血压患者接受缬沙坦（80 mg/日）治疗7天，血小板PAR4表达自第2天起时间依赖性下降，伴随TGF-β1和p-Smad2水平降低，PAR1表达不变。AYPGKF诱导的血小板聚集在7天内逐步减弱，离体微流控血栓形成在7天后明显减少。SHRs和L-NAME诱导的高血压小鼠经缬沙坦（10或20 mg/kg/日）治疗7天后，体内FeCl?诱导的血栓形成显著受抑。

**四、讨论与结论总结**

研究人员指出，本研究揭示了高血压状态下血小板PAR4转录上调的新机制——Ang II驱动的TGF-β1/Smad2信号通路。该通路通过Smad2直接结合PAR4启动子上的特异性反应元件，选择性上调PAR4基因转录（PAR1不受影响），进而增强Gq和G12/13下游信号传导，放大凝血酶诱导的血小板激活反应并促进动脉血栓形成。血小板源性TGF-β1在这一过程中发挥自分泌/旁分泌放大作用，构建了高血压促血栓形成的正反馈回路。

从临床转化角度看，PAR4表达水平与血小板活化标志物密切相关，PAR4被确立为高血压人群中颇具潜力的抗血小板新靶点。缬沙坦通过抑制Ang II/TGF-β1/Smad2信号通路，在降压之外逆转PAR4过表达并抑制血栓形成，为ARBs的多效性抗血栓药理机制提供了直接证据——这为临床上合理选择抗高血压药物以降低心血管并发症风险提供了理论基础，尤其对血小板PAR4高表达的高危高血压患者具有重要意义。

研究结论明确阐述：血管紧张素II驱动的TGF-β1信号通路上调血小板PAR4转录，从而增强高血压状态下的血小板活化；缬沙坦可逆转血小板PAR4过表达以抑制血栓形成，揭示了ARBs在高血压中一种新的多效性抗血栓药理机制。