OsDUF1223负调控水稻幼苗抗旱性并调节硝酸盐依赖性根系生长

《PLOS Genetics》：OsDUF1223 negatively regulates seedling drought tolerance and modulates nitrate-dependent root growth in rice

　　

水稻（Oryza sativa L.）是全球主要的粮食作物。极端天气引发的干旱胁迫严重限制其生长和产量。含未知功能结构域（domain of unknown function，DUF）的蛋白在植物逆境响应中发挥重要作用，但其调控机制仍不清楚。本研究表明，质膜定位蛋白OsDUF1223在水稻幼苗中作为抗旱性的负调控因子发挥作用。在干旱胁迫下，OsDUF1223过表达株系表现出较低的存活率、较高的失水率以及降低的抗氧化酶活性和渗透调节物质积累。转录组学和生理学分析揭示，OsDUF1223通过脱落酸（abscisic acid，ABA）信号和氮响应途径调节干旱响应。综上所述，本研究阐明了OsDUF1223通过与ABA和氮信号通路的功能关联调控水稻幼苗期抗旱性，从而为水稻抗旱性的遗传改良提供候选基因资源。

OsDUF1223通过ABA信号与氮代谢关联负调控水稻幼苗抗旱性——论文解读

水稻（Oryza sativa L.）是全球约50%人口的主粮作物，在全球粮食安全中具有举足轻重的地位。然而，全球变暖导致的降水格局紊乱使极端干旱事件日益频繁，干旱已成为限制水稻生长和产量最重要的环境因子之一。植物对干旱的响应是一个涉及信号感知、转导和生理生化应答的多层次调控网络，其中脱落酸（ABA）信号通路和氮代谢在干旱适应中发挥关键作用。含未知功能结构域（DUF）的蛋白家族在植物生长发育和胁迫适应中具有重要调控功能，但大多数成员的生物学功能仍未被解析。因此，挖掘并解析DUF家族成员在干旱响应中的功能，对于阐明植物抗旱调控网络和培育抗旱水稻品种具有重要意义。

研究人员以水稻幼苗为材料，系统研究了OsDUF1223在干旱胁迫响应中的功能。该基因编码一个定位在质膜的外周膜相关可溶性蛋白。通过过表达和基因敲除策略，结合转录组测序（RNA-seq）、生理生化指标测定、气孔形态观察及外源激素和硝酸盐处理实验，揭示了OsDUF1223作为负调控因子参与水稻幼苗抗旱性的分子机制。研究发现OsDUF1223通过功能关联ABA信号通路和氮代谢通路来调节干旱响应，为水稻抗旱性遗传改良提供了新的候选基因资源。该论文发表在《PLOS Genetics》。

在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：利用系统发育分析和MEME基序分析进行生物信息学预测；通过RT-qPCR和proOsDUF1223::GUS转基因植株组织化学染色分析基因表达模式；在烟草（Nicotiana benthamiana）表皮细胞中采用共定位实验验证蛋白亚细胞定位；利用农杆菌介导的遗传转化获得过表达株系（以Nipponbare为背景，由武汉天问生物技术有限公司提供）和敲除株系（以中花11为背景，由百格生物技术有限公司提供）；采用PEG模拟干旱和土壤干旱盆钵试验进行抗旱性鉴定；运用DAB/NBT染色、SOD活性与MDA/脯氨酸/可溶性糖含量测定评估生理响应；通过扫描电镜观察叶片气孔形态；利用RNA-seq进行转录组分析，并对关键基因进行RT-qPCR验证；采用外源ABA、丁康唑（ABA合成抑制剂）和不同浓度硝酸盐处理解析信号通路。

研究结果主要包含以下内容：

**生物信息学分析**：OsDUF1223基因（LOC_Os07g37310）位于水稻7号染色体，开放阅读框编码274个氨基酸残基，预测分子量约28.97 kDa。系统发育分析显示，来自水稻、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、小麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）、黄瓜（Cucumis sativus）、大豆（Glycine max）、番茄（Solanum lycopersicum）、白杨（Populus tomentosa）和玉米（Zea mays）的DUF1223家族成员序列高度保守。

**OsDUF1223在幼苗期特异表达并对干旱和外源ABA均有响应**：RT-qPCR分析显示，20% PEG处理下OsDUF1223转录水平在0.5 h达到峰值；50 μmol/L ABA处理下表达先升后降，1 h时为对照的5.96倍。GUS染色证实5日龄幼苗地上部信号在胁迫0.5 h后显著增强。时空表达分析表明该基因在幼苗期表达最高，孕穗期仅在花药中有微弱表达，提示其功能主要局限于幼苗阶段。

**OsDUF1223转基因植株的获得及蛋白亚细胞定位**：获得Nipponbare背景过表达纯合系（OE-1、OE-4、OE-5）和中花11背景敲除纯合系（KO-1、KO-2），敲除系均存在1 bp缺失导致移码突变。拓扑结构预测和共定位实验共同证实OsDUF1223以非跨膜方式定位在质膜（Pearson相关系数0.835）。

**OsDUF1223降低水稻幼苗抗旱性**：10% PEG轻度干旱处理8天后，过表达系株高显著低于野生型，而根长差异消失。三叶期土壤极端干旱试验中，过表达系复水后存活率为29.9%、33.4%和41.7%，显著低于Nipponbare的68.8%；敲除系存活率56.2%和64.8%，显著高于ZH11，表明OsDUF1223负调控水稻幼苗抗旱性。

**OsDUF1223转基因植株抗旱性指标的测定**：干旱处理后，过表达系叶片H₂O₂和O₂^?积累显著增多，超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸和可溶性糖含量显著降低，丙二醛（MDA）含量显著升高；敲除系则呈现相反趋势，表明OsDUF1223表达水平与活性氧清除能力和渗透调节能力呈负相关。

**OsDUF1223通过调节气孔形态特征影响失水率**：过表达系失水率显著高于野生型，其保卫细胞显著变长而气孔密度显著降低，导致气孔孔隙面积指数（SPI）显著下降；敲除系保卫细胞变短、气孔密度升高，SPI与野生型无显著差异。这种形态与功能间的表观矛盾可能与大保卫细胞关闭动力学迟缓有关。

**OsDUF1223过表达系响应干旱胁迫的转录组分析**：RNA-seq分析显示，处理前过表达系有132个上调基因和196个下调基因，上调基因富集于“氮代谢”和“脂肪酸延长”通路。胁迫后各时间点共有30个共同差异表达基因，其中下调基因包括OsJAZ2、OsWRKY118、OsSMAX1等，上调基因包括OsBURP16和OsRNR10。GO富集分析显示各时间点差异基因均显著富集于非生物刺激响应和胁迫响应通路。

**OsDUF1223调节激素信号通路基因表达并影响内源激素稳态**：差异表达基因热图显示ABA和茉莉酸（JA）信号通路组分显著受影响。OsDUF1223表达受外源MeJA诱导。干旱处理后，敲除系内源ABA含量显著高于ZH11，而过表达系ABA含量低于Nipponbare，表明OsDUF1223可能通过调节ABA稳态影响抗旱性。

**OsDUF1223正调控ABA信号通路，ABA是必需的下游信号**：外源ABA和丁康唑处理后，过表达系表现出更强的生长抑制，而敲除系敏感性降低。20% PEG与50 μmol/L ABA联合处理消除了各株系间失水率差异，且诱导过表达系气孔关闭，证明ABA是OsDUF1223调控抗旱性的必需下游信号。

**OsDUF1223通过参与氮介导的根系结构调控影响抗旱性**：在2 mmol/L NO₃^?条件下，过表达系根长显著长于野生型，敲除系根长显著短于ZH11。在无氮和低氮（0、0.2 mmol/L）条件下，过表达系根长显著短于野生型，而正常和高氮条件下无差异，表明OsDUF1223对根系生长的调控呈硝酸盐浓度依赖性。

讨论部分指出，OsDUF1223敲除系在干旱胁迫下具有更强的活性氧清除能力、更高的渗透调节物质积累和更稳定的膜系统。在ABA调控方面，研究人员提出了“低含量、高敏感性”模型：OsDUF1223过表达通过下调OsbZIP23及其下游靶标OsPP2C49，在解除信号抑制的同时减弱ABA生物合成，使植株维持低ABA水平但处于高应激警觉状态，这一状态在干旱来临时不足以启动充分的ABA响应。在氮代谢方面，OsDUF1223以硝酸盐浓度依赖方式重塑根系结构，但其与ABA信号的交互机制仍需进一步验证。研究同时指出，过表达系与敲除系采用不同遗传背景、缺乏直接蛋白互作证据、尚未进行严格的遗传因果验证等局限性。综上，该研究揭示了OsDUF1223通过功能关联ABA信号和氮代谢通路负调控水稻幼苗抗旱性的分子框架，为水稻抗旱分子育种提供了重要候选基因资源和理论依据。