《Briefings in Bioinformatics》：Amplification bias in sequencing-based spatial transcriptomics: sources, mechanisms, impacts, and mitigation strategies
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空间转录组学（ST）已成为在时空组织背景下解析基因表达谱的强大方法；然而，其定量准确性仍受到复杂文库制备过程中引入的扩增偏倚的显著损害。这些偏倚在多个阶段产生并在整个实验流程中累积，扭曲转录本丰度、降低检测灵敏度，并最终干扰下游空间分析。本综述系统分析了ST中
空间转录组学（ST）已成为在时空组织背景下解析基因表达谱的强大方法；然而，其定量准确性仍受到复杂文库制备过程中引入的扩增偏倚的显著损害。这些偏倚在多个阶段产生并在整个实验流程中累积，扭曲转录本丰度、降低检测灵敏度，并最终干扰下游空间分析。本综述系统分析了ST中的扩增偏倚。研究人员考察了输入模板、寡核苷酸组分特征、酶学性质及实验条件如何共同促成扩增偏倚，并讨论了这些因素如何通过流程传播以在数据中产生系统性扭曲。研究人员进一步回顾并批判性比较了现有缓解策略，涵盖实验优化与计算方法，并提出依据平台类型、样本质量及RNA输入水平选择扩增偏倚缓解策略的实用决策框架。最后，研究人员概述了关键挑战与未来方向，强调需联合考虑实验设计与计算建模的整合解决方案。本工作为提升ST数据保真度与解释性提供实用指导。
研究背景与问题提出
空间转录组学（ST，Spatial Transcriptomics）自2016年St?hl等人开创以来，将基因表达谱与完整组织中的空间定位相结合，其中基于测序的ST因高通量与全转录组覆盖成为主流。典型流程包括组织处理、文库制备、测序与下游分析，每一步均可引入技术变异。临床中大量使用的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织存在RNA交联与降解，加之活检样本量小、捕获区小导致RNA输入极低，迫使文库制备高度依赖扩增。扩增（如聚合酶链反应（PCR）、滚环扩增（RCA））带来非线性动力学、序列依赖偏倚与随机采样效应，压缩表达动态范围、低估低丰度转录本、破坏真实丰度与读数计数间线性关系，甚至将技术变异误读为空间异质性。尽管既往综述多聚焦平台开发或多组学整合，扩增偏倚的起源、定量后果与缓解仍缺乏系统梳理。该论文发表于《Briefings in Bioinformatics》，旨在从分子决定因素到计算校正层面对此进行系统综述，并提出按平台、样本质量与RNA输入量选择策略的决策框架。
主要关键技术方法
研究人员采用文献综述与机制归纳法，整合基于测序ST（如10× Genomics Visium、Slide-seq、Stereo-seq、DBiT-seq等）与成像基ST（如ISS、MERFISH、Xenium）的平台对比；样本维度涵盖新鲜冷冻与FFPE临床/转译队列来源。关键评估手段包括：外部RNA spike-in对照（ERCC、SIRV）定量扩增线性；唯一分子标识符（UMI）去重；逆转录酶（RT）与DNA聚合酶（DNAP）酶学参数表（如RNase H活性、保真度、Processivity）比对；以及计算层UMI-tools、SAVER、MAGIC、Salmon、SpotSweeper、SpaNorm等多类校正模型的概念框架整合。无新实验，属系统综述与决策框架建构。
研究结果
Sources and mechanisms of amplification bias（扩增偏倚来源与机制）
研究人员将偏倚源分为四类。模板相关偏倚：组织渗透性差异、FFPE甲醛加合物与RNA-蛋白交联、poly(dT)对完整poly(A)偏好致3′覆盖偏倚、GC含量与二级结构（茎环>20 nt抑制PCR）引起RT与聚合酶停顿。捕获探针/接头/引物偏倚：Visium捕获探针含空间条形码+UMI+poly(dT)长达60 nt，阵列密度不均；接头GC与二聚体竞争测序深度；随机六聚体引物存序列上下文非均匀性。酶学偏倚：RT无校对且RNase H降解模板，DNAP对高GC/长模板效率降；Phi29对富含G模板扩增速低；FFPE残留PFA与炎症区蛋白酶抑制酶活性。热循环与参数偏倚：退火温度、循环数（低模板下随机漂移被指数放大）、升降温速率致GC丰富模板变性不全；Illumina桥式PCR与边合成边测序（SBS）亦引入偏倚。
Impact of amplification bias on ST data analysis and biological interpretation（对数据分析与生物学解释的影响）
ST稀疏性超单细胞RNA测序（scRNA-seq），dropout常>90%。扩增偏倚扭曲观测读数与原丰度比例，压缩动态范围，低丰度丢失；过量PCR降低库复杂度，Parekh等估每增1循环统计效能降约2.4%（log?FC=0.5场景，源于bulk/scRNA-seq推演，ST未系统验证）。FFPE致C>T/G>A错配假变异。肿瘤微环境推断若基于被偏倚扭曲的协调表达，可误读细胞通讯。成像基方法因非PCR扩增偏倚较弱。
Correction and optimization strategies for amplification bias（校正与优化策略）
实验层：PCR-free因RNA输入过低不可行；ERCC不适用组织释放模拟，SIRV更近内源但占比宜低，加标时机分同步/迟加；UMI去重为标准；RT选SuperScript IV、Maxima H?（RNase H缺陷）提效；PCR用KAPA HiFi、Q5高保真控循环<10–15；模板切换寡核苷酸（TSO）捕全长；SHERRY免二链合成；分隔扩增（乳液PCR、微流控、琼脂糖PCR）降竞争；线性扩增（IVT、LIANTI、MDA、MALBAC）减指数偏倚。各平台（Visium HD多尺度binning、Stereo-seq DNB阵列限扩增次）内建缓解见表2。
计算层：UMI-tools/Cell Ranger分子去重；SAVER贝叶斯收缩补 dropout（慎防抹平真零）；MAGIC图扩散迁ST需嵌坐标形态，SpatialMAGIC预印本未审；LiBiNorm校长度偏倚，Salmon校GC/序列组成；SpotSweeper检局部spot离群，SpaNorm分库大小与空间信号。构成分子→统计→偏倚感知→空间QC四级框架。
A practical framework for selecting amplification bias mitigation strategies（实用决策框架）
研究人员依图3决策树：先分成像基（低危，双臂探针/RCA信号放大）与测序基（全转录组，通用UMI+高保真酶+低循环+计算校正）；测序基再按FFPE（DV200≥30中危/＜30高危，加随机引物、短片段捕获、技术重复）与新鲜冷冻（低输入/低密度高危，加RNase H? RT、TSO、分隔扩增；高输入中危）；终以spike-in与技术重复验证。
讨论与结论翻译
讨论指出扩增偏倚源于分子、技术、实验多维交织，分子特征定偏倚方向，仪器与条件定放大强度。现有实验与计算法互补但无单一最优，需按平台-样本-输入量组合选型。未来方向强调实验设计与计算建模联合求解，如过程匹配spike-in、空间感知偏倚模型、酶定向进化（高processivity、耐二级结构）。结论部分译文：扩增偏倚是基于测序ST定量失真的主要技术根源之一，贯穿模板捕获至SBS全流程；研究人员通过分类其来源、量化其下游后果、对比实验与计算缓解手段，并提出分层决策框架，为提升ST数据保真度与空间模式解释力提供实用路径，特别利于FFPE临床队列与低输入显微平台的可重复分析。
