仿生眼体外模型研究血-视网膜屏障病理生理学

《ACS Biomaterials Science & Engineering》：A Biomimetic Eye In Vitro Model to Investigate the Blood-Retinal Barrier Pathophysiology

　　

现有的视网膜病理性在体模型成本高昂、耗时且面临监管挑战，这促进了能够复制血-视网膜屏障的先进体外模型研究兴趣。与血管化和结构多尺度相互作用相关的挑战阻碍了体外模型的发展，而这些模型对于研究视网膜与体循环之间的营养物质和药物交换非常有用。为解决这些问题，研究人员开发了一种用于研究视网膜病理生理学的血-视网膜屏障体外模型。该模型具有一个置于培养室（玻璃体）与仿生微流控网络（脉络膜血管）之间的电纺支架（Bruch膜）。该网络以人视网膜吲哚菁绿血管造影为模型，激光雕刻于15 mm PDMS圆盘中，通道宽度为70–800 μm。研究人员研究了PLGA和明胶电纺支架以模拟Bruch膜。支架固定于微流控网络，组装到培养室中，并集成于生物反应器内。蠕动泵确保通道内流体持续流动。生物学验证包括在Transwell、PLGA或明胶膜上培养的ARPE-19细胞、膜耦合微通道内的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）以及双层构建体。研究人员对细胞进行单独及联合检测，以评估上皮、内皮及构建体反应。所有配置在28天内均显示代谢活性逐渐增加且乳酸脱氢酶（LDH）释放有限。与无细胞对照相比，接种细胞的构建体降低了FITC-葡聚糖转运，在第21天和第28天之间保持稳定值。空白校正的跨上皮电阻（TEER）同样在ARPE-19培养期间增加并于第21天达到平台期。PLGA构建体显示出最大的电阻和溶质转运阻力，尽管无细胞对照证实了材料的实质性贡献。共聚焦显微镜显示HUVEC沿微通道附着并形成F-肌动蛋白组织，而ARPE-19单层表现出连续的连接相关ZO-1染色，在第21天至第28天之间保持稳定。总体而言，该平台支持长期上皮-内皮培养，并提供了一个稳定的、可灌注的系统，用于研究oBRB转运和细胞相互作用。

论文解读：仿生眼体外模型及其在血-视网膜屏障病理生理学研究中的应用

一、研究背景与意义

人眼是负责视觉的重要且复杂的器官，其后段由玻璃体、视网膜、脉络膜和视神经组成，将光信号转换为大脑可处理的信息。在视网膜层面，视网膜色素上皮（RPE）细胞通过基底膜即Bruch膜与脉络膜毛细血管的内皮细胞相连接，这一结构被称为外血-视网膜屏障（oBRB），调控体循环与内视网膜之间的营养物质转运和药物通过。多种眼部疾病与衰老密切相关，如青光眼（全球超7600万患者）、糖尿病视网膜病变（超1.03亿患者）和年龄相关性黄斑变性（AMD，影响2亿人），这些疾病严重影响视力和生活质量。

目前视网膜研究广泛使用动物模型（如猪和小鼠），但由于人与动物解剖生理学差异，仅少数模型具有较高的人类转化价值。此外，动物模型成本高、耗时长，且欧盟指令2010/63/EU建议减少其使用。因此，开发能够模拟后眼段解剖和生理的复杂体外模型，特别是模拟在药物可用性调控中起关键作用的oBRB，具有重要的研究意义和转化价值。

现有器官芯片装置虽能在微观水平模拟特定屏障结构或功能并诱导细胞分化，但缺乏模拟眼解剖或视网膜组织结构的宏观尺度组织。已有oBRB体外模型通常缺乏可灌注的血管结构以及再现后眼结构所需的多尺度组织。为克服这些局限性，研究人员开发了一种模块化oBRB平台，该平台集成了Bruch膜启发的电纺基底、ARPE-19上皮层和代表脉络膜血管的可灌注HUVEC衬里微血管网络，并比较了合成PLGA与天然明胶膜作为替代基底。

二、关键技术方法概述

该研究采用多项关键技术。首先，利用激光雕刻技术在PDMS基底上制备仿生微血管网络（MVN），其图案来源于人脉络膜血管的吲哚菁绿血管造影图像经二值化和形态学操作处理。其次，采用静电纺丝技术分别制备PLGA和明胶电纺膜模拟Bruch膜。再次，通过计算流体力学（CFD）分析优化微通道内的流速和壁面剪切应力。此外，构建了包含玻璃体房室、Bruch膜样支架和脉络膜血管网络的三层模块化生物反应器系统，并通过蠕动泵实现动态灌注。生物学验证采用ARPE-19细胞和HUVEC细胞进行单培养和双层共培养，运用MTT代谢活力测定、LDH细胞毒性释放、跨上皮电阻（TEER）测量、FITC-葡聚糖通透性实验和免疫荧光染色（ZO-1和F-肌动蛋白）等手段评估屏障功能和细胞行为。该研究未涉及人类样本队列。

三、研究结果

有限元分析：计算流体动力学分析表明，所设计的微流控网络在不同入口流速和出口压力组合下均产生相同形式的速度分布和压力分布，仅最大值有所变化。所有参数情况下血管网络的壁面剪切应力均低于已知可导致细胞脱落的值（约2 Pa）。

微流控血管网络制备：激光雕刻工艺制备的MVN通道宽度与设计值之间存在51±21 μm的误差，小通道偏差更明显（设计40 μm宽实测70 μm），大通道（800 μm宽）偏差可忽略。通道深度实测为298±16 μm，与设计值（300 μm）接近，通道轮廓在各尺寸下保持正弦形状。

Bruch膜样电纺支架表征：明胶膜纤维直径为0.399±0.253 μm，厚度为85.56±35.48 μm；PLGA膜纤维直径为1.867±0.584 μm，厚度为101.70±16.77 μm。湿态下明胶膜小变形弹性模量为0.800±0.427 MPa，PLGA为62.940±4.896 MPa；两者湿态切线模量分别为2.532±0.400 MPa和0.553±0.229 MPa，均在天然Bruch膜（1–18 MPa）及既有支架（3–130 MPa）范围内。

生物反应器组装：PDMS表面经明胶-GPTMS改性后成功实现薄膜铺展和膜固定以封闭MVN通道开口端。模块化设计确保腔室无泄漏封闭，预成型孔位便于输入输出针头插入。蓝色染料灌注实验证实通道网络和腔室均无泄漏。

MTT代谢活力：所有实验配置的MTT吸光度在28天内均持续增加，最大变化一般发生在第1至第7天。ARPE-19单培养中PLGA在所有时间点均显著高于Transwell；第5天起明胶显著高于Transwell。HUVEC单培养中PLGA和明胶间无显著差异。双层构建体中第3天起PLGA显著高于明胶。这些结果表明所有配置均维持了持续的代谢活性，且ARPE-19培养存在材料依赖性反应。

LDH释放：所有含细胞组在28天培养期间LDH释放保持在最大裂解对照的40%以下。ARPE-19单培养中，电纺膜上的LDH释放始终高于Transwell（P<0.0001），第7天起PLGA高于明胶。HUVEC单培养和双层构建体中均未检测到PLGA与明胶之间的显著差异。因此，LDH释放总体远低于最大裂解对照，支持28天培养期间持续的细胞相容性和有限的细胞膜损伤。

跨上皮电阻（TEER）：所有组TEER随时间逐渐增加，显示紧密连接组装和屏障成熟的逐步进行。第5天PLGA（29.01±2.18 Ω cm2）>明胶（19.38±2.09 Ω cm2）>Transwell（15.69±1.32 Ω cm2），表明电纺基底上屏障形成更快。第21天后各条件增量极小趋于平台期，第28天PLGA（58.61±1.69 Ω cm2）>明胶（49.34±2.03 Ω cm2）>Transwell（43.94±1.21 Ω cm2），与成熟RPE单层在连接组装完成后电阻稳定的行为一致。

FITC-葡聚糖通透性：ARPE-19培养中，PLGA在两天均表现最低转运，明胶居中，Transwell最高；各基底内第21天与第28天之间无显著差异。HUVEC衬里微通道中亦未检测到第21天与28天之间的显著差异。无细胞对照的FITC-葡聚糖转运高于相应细胞接种构建体，且呈现相同的基底依赖性层级（PLGA最低，明胶次之，Transwell最高），说明所测转运反映了细胞屏障和支撑材料的综合贡献，无细胞对照对区分材料依赖性与细胞介导屏障功能至关重要。

HUVEC在膜耦合微通道内的组织：第28天共聚焦成像显示，在单通道、通道连接处和多通道区域均存在广泛的F-肌动蛋白阳性细胞覆盖。横截面重建证实细胞沿通道壁弯曲几何排列，DAPI阳性细胞核分布于鬼笔环肽阳性结构中，定性验证了HUVEC在可灌注微通道网络中的附着、分布和细胞骨架组织。

ZO-1免疫荧光及定量分析：所有基底上ARPE-19细胞均显示连续的沿细胞边界的ZO-1多边形染色模式。各基底内第21天与28天之间ZO-1平均荧光强度无显著差异，表明连接信号在晚期培养期间保持稳定。PLGA培养显示数值高于明胶和Transwell，但因统计分析仅比较各基底内的两个时间点，不能解释为显著的基底依赖性效应。

四、讨论与结论

研究表明，与现有器官芯片系统相比，该oBRB模型结合了宏观结构真实性和微观功能。激光雕刻PDMS可实现快速、可重复的仿生微血管网络制备，几何误差在可接受范围内。基于电纺Bruch膜类似物的支架界面通过使用不同材料提供可调性质，24孔板格式适用于常用药物筛选浓度和体积。

电纺膜的弹性模量和切线模量均在天然Bruch膜和既有支架范围内。尽管两膜在形态上未达到天然Bruch膜ECM纤维尺寸（约60 nm），更厚的膜从可制造性角度是有利的，可保证更易操作和稳定的结构并减少批次间变异性。与Transwell相比，两种电纺基底均支持更高的代谢活性、更早的屏障形成、更低的旁细胞通透性以及更佳的ZO-1紧密连接组织，PLGA表现最为突出。无细胞对照证实膜材料固有性质直接贡献于电阻和FITC-葡聚糖限制，而细胞接种提供了额外屏障。

该模型的MVN将脉络膜血管的三层结构整合为单一平面结构，虽简化了天然脉络膜血管网络的架构，但生成的半圆通道比软光刻技术制备的方形截面更具生理相关截面形态，同时保持了类似天然脉络膜脉管系统的复杂分支几何。70 μm宽通道区域接近最小脉络膜毛细血管（20–50 μm）的尺寸，增强了生理相关性。

研究结论指出，该模型再现了视网膜、Bruch膜和脉络膜血管的相对尺寸和空间组织，覆盖约70 mm2的生理相关面积，据研究人员所知是迄今报道的最大的仿生血-视网膜屏障界面。ARPE-19单培养、HUVEC单培养和双层ARPE-19/HUVEC构建体均可维持至28天，PLGA表现出最佳综合性能。TEER、FITC-葡聚糖转运和ZO-1组织在第21至28天保持稳定，表明建立了稳定的晚期培养上皮屏障。但该生物学验证应视为概念验证，当前数据尚不能完全区分各支架特性对上皮和内皮层形成的单独贡献。局限性包括支架厚度大于天然组织可能影响扩散动力学、雕刻血管通道宽于人类脉络膜毛细血管且缺乏体内观察到的层级分支、模型为平面结构而弯曲设计可能更符合后眼凹度、HUVEC不能完全再现眼部内皮细胞表型。未来工作应侧重于共培养和动态灌注条件下的系统全面表征、临床相关药物评估、支架厚度减薄以及使用更代表脉络膜微血管的内皮细胞群体。该模块化制造策略也可通过调整支架成分和微流控架构推广至其他生理屏障的体外重建。总之，该研究建立了一个大规模、模块化、可灌注的oBRB平台，为视网膜转运、上皮-内皮相互作用、眼科药物筛选和疾病建模研究提供了坚实基础。