基于红色荧光蛋白与合成螯合剂的化学遗传学Ca2+指示剂

《ACS Chemical Biology》：A Chemigenetic Ca2+ Indicator Based on a Red Fluorescent Protein and a Synthetic Chelator

　　

化学遗传学（chemigenetic）Ca²⁺指示剂是一种将合成螯合剂与蛋白质支架相结合的杂交型生物传感器设计策略。研究人员此前报道了一种将绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）与合成螯合剂相结合的化学遗传学指示剂设计，旨在整合传统蛋白质类生物传感器与合成化学传感器的各自优势。本研究进一步证明，该化学遗传学设计可拓展至红色荧光蛋白（red fluorescent protein, RFP）体系。研究人员通过筛选一系列具有不同发色团-螯合剂相对取向的变体，并结合定向进化（directed evolution）策略，开发出一种基于红色荧光蛋白的钙离子（Ca²⁺）指示剂。在纯化蛋白水平上，当Ca²⁺浓度从0增加至39 μM时，该指示剂表现出5.4倍的荧光强度变化。尽管当前版本的指示剂在哺乳动物细胞中表达时功能丧失且选择性较低，但上述研究结果确立了该化学遗传学设计作为一种可拓展至其他荧光蛋白颜色变体的通用策略。

**论文解读：基于红色荧光蛋白与合成螯合剂的化学遗传学Ca²⁺指示剂的开发**

**一、研究背景与问题**

荧光指示剂是可视化生物过程中时空动态变化不可或缺的成像工具，其通过响应特定生物事件而改变荧光性质，能够以高时空分辨率监测多种分子和离子的浓度变化。钙离子（Ca²⁺）作为重要的第二信使，在细胞信号转导中发挥关键作用，Ca²⁺指示剂的发展已深刻推动了细胞生物学和神经科学的研究进程。

自20世纪80年代初起，研究人员不断拓展荧光指示剂的光谱多样性与目标分析物范围。最早的指示剂为合成分子，由小分子螯合剂与荧光团共价连接而成，兼具荧光团的优异光物理性质与螯合剂的选择性金属离子结合能力。20世纪90年代末期以来，基于蛋白质的指示剂通过将荧光蛋白与分析物结合域融合而发展起来，其主要优势在于生物相容性和基因可编码性，且可通过蛋白质工程系统优化其功能特性。此后，第三种“化学遗传学”类别作为杂交策略出现，将合成指示剂与蛋白质类指示剂的优势相结合。该方法依赖于自标记标签蛋白（如HaloTag、SNAP-tag等），能够选择性共价偶联互补的合成配体。

研究人员此前报道了一种新型化学遗传学Ca²⁺指示剂HaloGFP-Ca1，其以绿色荧光蛋白（GFP）作为报告域，以合成Ca²⁺螯合剂1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸（BAPTA）作为传感域，通过HaloTag连接。该指示剂在Ca²⁺结合诱导的构象和静电相互作用变化下，可产生高达920%的ΔF/F₀荧光响应。然而，该策略能否拓展至基于红色荧光蛋白（RFP）的指示剂仍属未知。红色荧光指示剂因与蓝至黄光谱范围内探针的光谱正交性以及在体成像的固有优势而具有高度需求，但RFP的性质与GFP差异显著，其指示剂的开发往往伴随额外挑战。因此，本研究旨在探索化学遗传学设计能否延伸至RFP体系。

**二、研究内容与主要技术方法**

本研究开发了HaloRFP-Ca1，一种基于RFP和合成螯合剂的化学遗传学红色Ca²⁺指示剂。研究首先通过系统筛选确定RFP发色团与BAPTA螯合剂之间的有效邻近性和相对取向；随后采用定向进化策略，通过多轮位点饱和突变和随机突变优化指示剂的动态响应范围。

主要关键技术方法包括：（1）构建嵌合蛋白文库——将环化排列的mApple（cpmApple）插入HaloTag的不同位置，获得34个变体；同时合成10种不同聚乙二醇（PEG）间隔臂长度和苯环连接位置的BAPTA-PEG-HaloTag配体，形成340种蛋白-配体组合进行原型筛选；（2）高通量荧光筛选——在大肠杆菌（*E. coli*）中表达蛋白后，与配体共孵育，在有无Ca²⁺条件下测量荧光强度变化；（3）定向进化——以初始原型为模板，进行四轮位点饱和突变和一轮随机突变，以及随后基于结构分析指导的六轮有益突变积累，最终获得HaloRFP-Ca1变体；（4）体外光物理性质表征——测定激发/发射光谱、吸收光谱、Ca²⁺滴定曲线、pH滴定曲线、量子产率、消光系数等参数；（5）哺乳动物细胞验证——合成四乙酸羟甲基酯（AM ester）衍生物，在HeLa细胞中尝试功能验证（该实验未获成功）。

**三、研究结果**

**（一）原型鉴定：筛选确定有效插入位点与配体组合**

研究人员基于HaloTag与合成染料共晶结构，在HaloTag的141-159、168-177和242-249区域内选择插入位点，这些区域溶剂暴露且靠近配体结合位点D106。将cpmApple插入后获得34个嵌合蛋白变体，与10种BAPTA衍生物配体组合后，对全部340种组合进行荧光测定。结果显示，大多数组合（包括HaloGFP-Ca1中使用的143-144插入变体）未表现出显著荧光变化；而将cpmApple插入α-螺旋中部的172-173变体与配体3（间隔臂n=4、5位连接）组合时，产生ΔF/F₀ = 0.8的荧光响应，被选定为初始原型（命名为HaloRFP-Ca0.1）。此外，研究人员还对环化排列的mRuby3、mCherry2和FusionRed等其他RFP进行了评估，但未发现更优组合。

**（二）定向进化：多轮突变累积实现性能提升**

以HaloRFP-Ca0.1为起点，研究人员首先参考HaloGFP-Ca1的进化过程中积累的九个突变位点，对连接区和对应位置进行靶向随机化。四轮位点饱和突变获得两个改进变体HaloRFP-Ca0.3a（ΔF/F₀ = 2.6）和HaloRFP-Ca0.3b（ΔF/F₀ = 2.0），其重组体HaloRFP-Ca0.4表现出最大的荧光响应。随后以HaloRFP-Ca0.4为模板，依据三个标准选择残基进行单残基随机化：（i）配体附近可能直接与BAPTA羧基相互作用的碱性残基；（ii）通过ColabFold和UCSF Chimera结构分析识别的潜在域间氢键网络残基；（iii）已有报道的RFP及RFP类生物传感器中发生突变的位点。通过逐轮筛选，共获得六个有益突变（D164E、K186V、H200W、M254R、M275K、N378K）。此后两轮随机突变未发现更优变体，该变体被确定为最终版本HaloRFP-Ca1。

**（三）体外表征：光物理性质与Ca²⁺响应**

体外光物理性质表征显示，HaloRFP-Ca1的激发峰约为560 nm，发射峰约为590 nm。与配体3结合后，荧光强度呈Ca²⁺依赖性增加：在0至约2 μM Ca²⁺范围内呈现S形上升，表观解离常数（K_d）约为200 nM；在更高浓度下荧光继续线性增加。无配体标记的蛋白在1 mM Ca²⁺浓度范围内无Ca²⁺依赖性荧光变化。量子产率（Φ）在pH 7.2下，无配体时为0.10，结合配体3后随Ca²⁺浓度从0.15（0 μM Ca²⁺）增至0.24（1.36 μM）和0.29（39 μM）；消光系数（ε）相应地从无配体时的1,600 M^–1 cm^–1增加至结合配体后的5,600（0 μM）、11,000（1.36 μM）和23,600 M^–1 cm^–1（39 μM）。分子亮度从0.16 mM^–1 cm^–1提升至6.84 mM^–1 cm^–1。纯化蛋白的ΔF/F₀在39 μM Ca²⁺条件下为5.4倍。pH滴定实验显示，无配体时pK_a为9.6，结合配体3后降至8.0，在Ca²⁺存在下进一步降至7.6。选择性测试显示，高浓度（1 mM）的Mg²⁺或Mn²⁺也可引发显著荧光增强，而在生理浓度Mg²⁺（1 μM）存在下无显著干扰。

**（四）机制探讨**

根据pH滴定和吸收光谱结果，研究人员推断Ca²⁺依赖的荧光增强主要由发色团的pK_a移动驱动。RFP发色团在质子化（酚式）状态下在约450 nm处有吸收但荧光较弱，在去质子化（酚盐式）状态下在约570 nm处有强吸收和荧光。HaloRFP-Ca1的荧光增加存在三个区间：第一个区间发生在螯合剂与蛋白结合时，分子亮度增大约4倍，推测cpmApple插入HaloTag α-螺旋中部改变了发色团环境，使平衡偏向非荧光的酚式状态，而BAPTA配体的结合使平衡移回酚盐式状态；第二个区间为约2 μM以内Ca²⁺依赖性响应，源于Ca²⁺与螯合剂的结合导致的pK_a移动，K_d与BAPTA及其他BAPTA类指示剂相近；第三个区间为高浓度（>2 μM）Ca²⁺下继续增加的荧光，可能源于高浓度二价阳离子条件下BAPTA的第二阳离子结合，引发构象变化，但该推测尚需进一步实验和计算研究验证。

**（五）哺乳动物细胞验证尝试**

研究人员合成了配体3的四乙酸羟甲基酯（AM ester）衍生物11，并在HeLa细胞中进行了功能验证。以HaloGFP-Ca1为对照确认了配体11的细胞内摄取和功能化，但HaloRFP-Ca1在哺乳动物细胞中对Ca²⁺浓度变化仅表现出微弱响应，推测是由于HaloTag部分在哺乳动物细胞中出现了意外的结合活性损伤。

**四、讨论与结论**

HaloRFP-Ca1具有多项有利性质，最显著的是红色荧光和作为纯化蛋白时较大的Ca²⁺响应幅度，但也存在亮度较低、选择性不高和哺乳动物细胞中功能缺失等局限性。其高性能仅在低浓度其他二价阳离子条件下于体外体现。尽管如此，本研究结果证明，通过筛选RFP发色团与合成螯合剂之间的位置关系，可以实现合成螯合剂对RFP荧光的调控，且这种相互作用可通过定向进化加以改善。

研究结论认为，本研究开发的HaloRFP-Ca1是一种基于RFP和BAPTA的化学遗传学红色荧光Ca²⁺指示剂。通过广泛的插入位点、RFP变体和配体几何构型的文库筛选确定了初始原型，并经过多轮定向进化提升了其性能，最终获得在体外对Ca²⁺具有较大响应的HaloRFP-Ca1。该研究证明了化学遗传学策略可拓展至GFP以外的其他荧光蛋白颜色变体，为开发传统指示剂开发仍具挑战性的多种离子的生物传感器提供了潜在途径。该成果发表在《ACS Chemical Biology》上，展示了化学遗传学设计在拓展多色荧光成像和多重参数成像应用方面的潜力。