内侧前额叶皮层通过自主神经系统调节脓毒症的外周免疫反应

《Anesthesia & Analgesia》：Medial Prefrontal Cortex Modulation of the Peripheral Immune Response in Sepsis Via the Autonomic Nervous System

　　

背景：脓毒症是一种由感染引起的宿主反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍综合征，其中神经免疫功能障碍在脓毒症的发生发展中起着核心作用。内侧前额叶皮层（mPFC）参与自主神经和免疫调节。然而，其在脓毒症期间调节外周免疫反应中的作用尚不明确。本研究探讨了mPFC中的谷氨酸能神经元是否通过自主神经通路和肾上腺素能信号通路调节脓毒症期间的全身性炎症和器官损伤。

方法：利用光遗传学激活或化学遗传学抑制技术选择性调控mPFC中的谷氨酸能神经元。小鼠被分为四个主要组别：ChR2组（光遗传学激活）、mCherry组（光遗传学对照）、hM4Di组（化学遗传学抑制）和EGFP组（化学遗传学对照）。随后通过腹腔注射大肠杆菌或盲肠结扎穿孔术（CLP）诱导脓毒症。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测血清和脾脏细胞因子，通过组织病理学评估器官损伤，并通过流式细胞术分析脾脏免疫细胞群和巨噬细胞极化。通过左侧颈部迷走神经切断术（LcVGX）、β2肾上腺素能受体（ADRB2）拮抗剂（ICI-118,551）以及通过6-羟基多巴胺（6-OHDA）进行脾神经去神经化来探索潜在机制。

结果：脓毒症显著激活了mPFC神经元。光遗传学激活mPFC谷氨酸能神经元可降低促炎细胞因子水平并减轻肝、肾和肺损伤，而化学遗传学抑制则加重全身性炎症和器官损伤。在机制上，激活mPFC神经元可促进巨噬细胞向M2表型极化，而抑制则使极化向M1表型偏移。左侧颈部迷走神经切断术（LcVGX）消除了mPFC激活的抗炎效果（M2巨噬细胞百分比：ChR2-假手术组与mCherry-假手术组比较，均值±SEM分别为19.4±0.87%与14.4±1.15%，P=.023；ChR2-LcVGX组与mCherry-LcVGX组比较，均值±SEM分别为14.0±0.89%与14.2±1.33%，P>.999；每组n=5），提示该效应依赖于迷走神经。此外，化学遗传学抑制增加了脾脏中ADRB2的表达，而ADRB2阻断或脾神经去神经化逆转了促炎性巨噬细胞极化（M1巨噬细胞百分比：hM4Di-生理盐水组与EGFP-生理盐水组比较，均值±SEM分别为30.8±1.71%与23.0±1.06%，P=.030；hM4Di-ICI-118,551组与EGFP-ICI-118,551组比较，均值±SEM分别为20.9±2.04%与21.6±2.14%，P=.992；hM4Di-6-OHDA组与EGFP-6-OHDA组比较，均值±SEM分别为26.3±3.00%与26.2±2.34%，P>.999；每组n=4）。

结论：mPFC中的谷氨酸能神经元在调节脓毒症期间的外周免疫反应中起着关键作用。mPFC通过涉及迷走神经和脾神经的自主神经通路以及依赖ADRB2的信号通路影响巨噬细胞极化、全身性炎症和器官损伤。靶向mPFC介导的神经免疫通路可能代表一种治疗脓毒症的潜在策略。

要点
问题：内侧前额叶皮层（mPFC）是否调节脓毒症期间的外周免疫反应和器官损伤？其潜在的神经免疫机制是什么？
发现：在脓毒症小鼠模型中，激活mPFC中的谷氨酸能神经元可减轻全身性炎症并降低器官损伤，而抑制这些神经元则加重炎症反应。这些效应与脾脏巨噬细胞极化的调节有关，并通过涉及迷走神经和脾神经的自主神经通路以及β2肾上腺素能受体（ADRB2）依赖的信号通路介导。
意义：这些发现表明，mPFC中的谷氨酸能神经元在调节脓毒症期间的外周免疫反应中起着关键作用。靶向mPFC介导的自主神经和ADRB2依赖的神经免疫通路可能代表一种有前景的治疗策略，用于调节全身性炎症并改善脓毒症预后。

脓毒症是一种由感染引起的宿主反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍综合征。1–3近年来，对脓毒症机制的理解有所加深。4–6然而，脓毒症仍然是一个需要紧急应对的严重临床问题。神经免疫功能障碍是免疫反应紊乱的关键因素7–9；因此，揭示神经元调节外周免疫的重要机制10,11有望为开发缓解脓毒症的新策略提供助力。

内侧前额叶皮层（mPFC）位于大脑皮层的额区，谷氨酸能神经元是mPFC中的主要神经元细胞类型之一。12 mPFC与皮层、皮层下和脑干的其他脑区形成广泛而复杂的神经环路，以调节情绪、记忆、社会行为、行为决策等高级活动。13已有研究表明，mPFC可能参与感染的免疫反应和全身性炎症反应的调节。14–16然而，mPFC神经元在脓毒症期间神经免疫调节中的作用仍不清楚。

自主神经系统（ANS）是重要的神经免疫调节通路。ANS通过交感神经和迷走神经平衡组织和器官的生理功能。17交感神经系统的激活通过诱导肾上腺素能神经递质（即肾上腺素和去甲肾上腺素（NE））的释放来调节免疫系统，这些神经递质作用于免疫细胞上的肾上腺素能受体。18迷走神经通过抗炎胆碱能通路持续监测和应对炎症刺激。19因此，我们假设mPFC通过自主神经系统信号通路调节脓毒症期间的外周免疫反应。

基于mPFC参与中枢自主神经和免疫调节的证据，我们假设mPFC内的兴奋性谷氨酸能神经元可调节脓毒症期间的外周免疫反应。具体而言，我们提出mPFC通过控制脾脏巨噬细胞极化来调节全身性炎症，这一效应由自主神经通路（包括迷走神经和脾神经）介导，并需要β2肾上腺素能受体（ADRB2）信号通路的参与。

方法
动物
C57BL/6J小鼠（8周龄）购自浙江大学动物中心。所有动物实验均按照浙江大学动物护理和使用委员会批准的方案进行。在开始实验程序之前，动物被饲养在标准条件（室温22–23°C；湿度40%–60%；12:12小时光照/黑暗周期）的独立笼中，自由获取常规食物和水。所有动物均适应至少1周。光遗传学激活和化学遗传学抑制技术完成后，使用成年（14–16周龄）雄性C57BL/6J（SLAC）小鼠进行实验。所有动物实验均经浙江大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（批准号2023485），并按照机构关于实验动物护理和使用的指南进行。所有程序均遵循体内实验动物研究报告（ARRIVE）指南，以确保动物研究的伦理和标准化报告。

mPFC病毒立体定向微量注射
腺相关病毒（AAV）2/9-人突触素（hSyn）-通道视紫红质-2（ChR2）-mCherry-土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）-polyA（pA）（货号S0312-9，Taitool）和AAV2/9-hSyn-mCherry-WPRE-pA（货号S038-9，Taitool）购自中国上海太拓生物。重组腺相关病毒（rAAV）2/9-hSyn-人毒蕈碱受体4化学遗传学受体Gi偶联（hM4D(Gi)）-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-WPRE-pA（货号PT-0153，BrainVTA）和rAAV2/9-hSyn-EGFP-WPRE-pA（货号PT-1990，BrainVTA）购自BrainVTA。具体而言，小鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉并固定在立体定向仪上；然后调整颅骨使其平行于参考面板。使用微量注射泵，将AAV缓慢注入mPFC（20 nL/min）。泵保持在原位额外10分钟后再缓慢撤出，以使病毒颗粒在注射位点扩散和吸收。对于mPFC局部光遗传学刺激，病毒注射至mPFC右侧（角度：14°，前后位距前囟2.43 mm，内外位0.7 mm，背腹位1.7 mm）。对于化学遗传学抑制，病毒双侧注射入mPFC。AAV注射后，小鼠被允许恢复并在实验前实现稳定病毒表达4–6周。

光纤植入
小鼠用戊巴比妥钠（100 mg/kg）麻醉并固定在小动物立体定向架上。将单模光纤植入右mPFC上方。在颅骨上钻三个小孔，将锚定螺钉插入并固定在硬脑膜上方的颅骨表面。手术后，小鼠被允许恢复至少一周后再进行后续实验。光遗传学刺激时，通过光纤在纤维末端以473 nm蓝光、20 Hz频率、5 ms脉冲宽度和5 mW输出功率照射20分钟。

C57BL/6小鼠大肠杆菌诱导的脓毒症模型
大肠杆菌（ATCC 25922）在Luria-Bertani琼脂平板上培养12小时。随后选取单个克隆接种至Luria-Bertani培养基中，在37°C下以200 rpm振荡培养10小时。制备细菌悬液用于后续实验。按照先前描述的方法20，通过腹腔注射7×10^6菌落形成单位（CFU）的大肠杆菌诱导脓毒症。挑战后立即用氯氮平-N-氧化物（CNO；5 mg/kg，BrainVTA）或蓝光处理4小时。

C57BL/6小鼠盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的脓毒症模型
腹正中切口后，找到盲肠并在回盲瓣下方基部用4-0丝线结扎。用18号针在盲肠的抗肠系膜缘穿刺一次，并轻轻挤压盲肠挤出少量粪便。所有小鼠皮下注射1 mL 0.9%生理盐水。假手术组小鼠接受上述相同程序，但不进行结扎和穿刺。

免疫荧光染色
完成实验方案后，处死小鼠，先以冰冷PBS灌注心脏，再以4%多聚甲醛（PFA）灌注固定脑组织。对表达ChR2动物的mPFC切片进行免疫染色。使用的抗体为兔抗c-Fos抗体（1:1000；货号ab222699，Abcam）和Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体（1:1000；货号A-11008，Thermo Fisher Scientific）。在最终孵育步骤中用DAPI（货号0100-20，Southern Biotech）对切片进行复染以确认注射位点。切片用FluorSave试剂（货号345789-20MLCN，Calbiochem）封片。

为了确认在表达hM4D(Gi)的脓毒症小鼠中哪些神经元或细胞被化学遗传学方法抑制，以及在表达ChR2的脓毒症小鼠中哪些神经元被光遗传学方法激活，我们对表达hM4Di或ChR2动物的mPFC切片进行了免疫染色。使用的抗体包括兔抗CaMKIIα抗体（1:500；货号ab5683，Abcam）、小鼠抗GAD67抗体（1:500；货号MAB5406，Millipore）、兔抗GFAP抗体（1:500；货号Z0334，Agilent）和豚鼠抗Sox10抗体（1:500；货号OB-PGP001，Oasis Biofarm）。切片用FluorSave试剂（货号345789-20MLCN，Calbiochem）封片。

组织病理学分析
小鼠颈椎脱臼处死，随后用4% PFA固定。CLP后7天获取肝、肾和肺组织。制备石蜡包埋切片并进行苏木精-伊红（H&E）染色。小鼠组织用4% PFA固定，经梯度乙醇系列脱水，石蜡包埋，用切片机切成4 μm厚切片。切片用二甲苯脱蜡，苏木精染色5分钟，盐酸-乙醇分化30秒，伊红复染2分钟。H&E染色切片用Olympus VS120显微镜（Olympus）成像。肝、肾和肺损伤程度按照先前描述的方法20评分。肝脏组织学评分根据出血和浸润的严重程度评定如下：出血：正常=0，轻度（<30%局部区域）=1，中度（30%–50%局部区域）=2，重度（>50%局部区域）=3；浸润：正常=0，轻度（炎性细胞2–3倍）=1，中度（炎性细胞3–10倍）=2，重度（炎性细胞>10倍）=3。肾脏损伤程度通过对每个样本中随机选择的10个区域的出血、刷状缘消失和管型形成进行评分。肾脏形态学改变按0至3+分级：0，正常；1+，轻微；2+，中度；3+，重度。所有区域的平均值作为每个样本的损伤评分。肺损伤严重程度使用四个标准评估：肺泡充血/出血、肺泡壁增厚、透明膜形成和白细胞浸润：正常=0，轻度（<20%受累）=1，中度（20%–40%受累）=2，中重度（40%–60%受累）=3，重度（60%–80%受累）=4，极重度（>80%受累）=5。研究人员在整个分析过程中对实验分组保持盲态。此标准化方案确保了病理量化的客观性和可重复性。

流式细胞术
从腹腔注射7×10^6 CFU大肠杆菌4小时后表达hM4Di且mPFC受到抑制的脓毒症小鼠以及表达EGFP的脓毒症小鼠的脾脏中分离细胞（在大肠杆菌挑战前给药CNO）。

脾脏单细胞悬液悬浮于PBS中，用指定抗体孵育，并进行流式细胞术检测细胞标志物的表达（补充数字内容，补充表S1A，https://links.lww.com/AA/F917）；门控设置基于t分布随机邻居嵌入（t-SNE）分析中识别的各细胞类型（FlowJo V10）。脾脏单细胞悬液在PBS中与指定抗体孵育后，进行流式细胞术检测（补充数字内容，补充表S1B，https://links.lww.com/AA/F917）。M2巨噬细胞的胞内染色使用抗CD206抗体和固定/透化试剂盒。数据采集在BD LSRFortessa上完成，并用FlowJo软件（TreeStar）进行分析。

**细胞因子水平测定**

在指定时间点通过眶后穿刺从小鼠体内采集血液样本。血液在室温下凝固2小时，随后在4°C下以14,000 rpm离心15分钟。收集血清上清液进行细胞因子分析。脾脏取出后立即置于液氮中速冻，并用研钵和研杵机械匀浆。随后向组织匀浆中加入500 μL含1% PMSF的RIPA缓冲液。混合物在4°C下以14,000 rpm离心15分钟，收集上清液进行细胞因子定量。按照制造商的推荐方案，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒分析血清和组织上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α；货号MTA00B，R&D Systems）、白介素-6（IL-6；货号M6000B，R&D Systems）和白介素-10（IL-10；货号M1000B，R&D Systems）的蛋白水平。

**液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析**

取50 μL血浆样品，加入300 μL乙腈（含内标氯雷他定，1 ng/mL），涡旋振荡3分钟，在4°C下以20,000相对离心力（RCF）离心10分钟，收集上清液进行LC-MS/MS分析。

**RNA测序**

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）分离和纯化总RNA。RNA-seq数据已提交至基因表达综合数据库（GEO），登录号为GSE308765。

**左侧颈迷走神经切断术（LcVGX）**

进行颈部前正中切口，暴露左侧颈迷走神经。然后用4-0丝线结扎迷走神经，并切除至少1 cm。手术部位用3-0缝线关闭。假手术对照小鼠仅暴露左侧迷走神经并小心分离周围组织，但不切断。小鼠在败血症模型建立前3天接受LcVGX或假手术。

**6-羟基多巴胺（6-OHDA）给药**

按照Zhai等人21建立的方法，通过脾内注射6-OHDA（货号H116，Sigma-Aldrich）诱导化学性脾神经去支配。麻醉小鼠后，经腹部手术将脾脏外翻。使用微量注射器（Hamilton），以60至120 μg/50 μL的剂量将6-OHDA（溶于含0.4%抗坏血酸的无菌生理盐水中）多点注射至脾实质（载体对照组接受等体积含0.4%抗坏血酸的生理盐水）。注射速率控制在1 μL/min，针头在位保持30秒后缓慢拔出。操作完成后，腹腔逐层缝合。

**ICI-118,551给药**

Zenidolol盐酸盐（ICI-118,551）（货号S8114，Selleck）用于选择性抑制小鼠的ADRB2，如Huang等人22先前所述。小鼠以2 mg/kg体重的剂量腹腔注射ICI-118,551。溶液用无菌生理盐水配制，每只动物注射终体积为100 μL。载体对照组接受等体积生理盐水。ICI-118,551在实验操作开始前1小时给药，以确保最佳受体拮抗效果。

**定量聚合酶链反应（qPCR）分析**

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Life Technologies）从冷冻组织匀浆中提取mRNA。使用SYBR PCR Master Mix（TaKaRa）和标准寡核苷酸通过qPCR测定组织样品中mRNA的相对表达水平。所有使用的引物列于补充数字内容，补充表S2中（https://links.lww.com/AA/F917）。

**统计分析**

样本量与我们的先前研究一致。21 样本量还根据相关方法学文献和近期动物实验研究23,24中使用的方法，采用资源方程法进一步确定。公式E = N ? B ? T，其中E代表误差自由度，N代表实验单元总数，B代表区组数，T代表处理组数。E值在10至20之间被认为是可接受的。对于本实验设计，计算的E值范围为10至18。对于两组、四组和六组设计，计算的E值分别为10、16和18，均在可接受范围内。所选样本量旨在将误差自由度维持在推荐范围内，同时按照动物研究的减量原则尽量减少动物使用。

为减少偏差，使用计算机生成的随机数将状况相似的小鼠随机分组。手术者在建立败血症模型时未设盲，但遵循标准化方案。结果评估由不知晓分组情况的研究人员进行。统计分析在分组身份揭晓前对编码数据进行。结果以均值±标准误（SEM）表示。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。评估组间差异时，当方差不齐时（两组）使用Welch校正的双侧Student's t检验，当两组多项结局时使用Holm-?idák校正的多次t检验。多组单因素比较使用方差分析（ANOVA）。当方差不齐时，使用Brown-Forsythe和Welch ANOVA后接Dunnett's T3事后检验。当Brown-Forsythe和Bartlett检验确认方差齐性时，使用普通单因素ANOVA后接Tukey事后检验进行多重比较。统计分析使用GraphPad Prism 10软件完成。P < .05被认为具有统计学显著性。

**结果**

**败血症诱导小鼠双侧mPFC的神经元激活**

为确定败血症期间激活的脑区，按照先前描述的方法20，通过腹腔注射大肠杆菌诱导败血症，并映射小鼠中即时早期基因c-Fos的表达。在败血症小鼠的mPFC中检测到c-Fos+神经元数量增加（c-Fos+神经元：IL区，败血症组 vs 对照组，78.0 ± 6.39/mm2 vs 48.8 ± 2.93/mm2，P = .008；PrL区，103 ± 18.4/mm2 vs 47.0 ± 4.24/mm2，P = .008；Cg1区，59.0 ± 8.69/mm2 vs 24.8 ± 4.77/mm2，P = .002），表明mPFC中的神经元被败血症激活（补充数字内容，补充图S1，https://links.lww.com/AA/F917）。这些结果表明败血症期间mPFC中神经元激活与免疫反应之间存在功能联系。

**mPFC中谷氨酸能神经元的激活可缓解败血症期间的全身性炎症和组织损伤**

目前尚不清楚mPFC是否在败血症中发挥免疫调节作用。为探索mPFC神经元激活在败血症中的作用，我们首先建立了一套光遗传学激活方案，通过向小鼠单侧mPFC局部注射表达工程化ChR2受体-mCherry的AAV2/9，随后进行蓝光照射来激活mPFC中的神经元活动（图1A）。按照此方案，ChR2-mCherry+细胞主要分布在mPFC中（图1B）。c-Fos+神经元分布于mPFC，几乎全部位于ChR2注射侧，证实了光遗传学方案高效特异性地激活了mPFC中的神经元（52.5 ± 5.54% vs 8.43 ± 1.30%，n = 5/组，P = .001）（图1C，1D）。使用免疫荧光双标记技术，我们发现小鼠mPFC中ChR2+细胞中，75.0%为钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II阳性（CaMKIIα+）兴奋性谷氨酸能神经元，约9.60%为谷氨酸脱羧酶67阳性（GAD67+）GABA能神经元。然而，无胶质纤维酸性蛋白（GFAP+）星形胶质细胞或SRY盒转录因子10阳性（Sox10+）少突胶质细胞表达ChR2（图1E-G及补充数字内容，补充图S2，https://links.lww.com/AA/F917）。这些结果表明，在我们的实验体系中，光遗传学激活mPFC中的ChR2+细胞主要激活了mPFC中的谷氨酸能神经元。

**图1. mPFC光遗传学激活可缓解败血症期间的全身炎症反应和组织损伤。** A，光遗传学激活方案示意图。B，腺相关病毒（AAV2/9-hSyn-ChR2-mCherry-WPRE-pA）构建体及注射至右侧内侧前额叶皮层（mPFC）。比例尺，0.2 mm。C和D，ChR2表达小鼠mPFC中通道蛋白-2（ChR2，红色）与c-Fos（绿色）共定位的代表性免疫荧光图像（n = 5）。c-Fos阳性神经元定量分析（D）。比例尺，50 μm。E和F，mPFC中通道蛋白-2（ChR2）与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II α（CaMKIIα）（E）或谷氨酸脱羧酶67（GAD67）（F）的共定位。箭头指示双阳性细胞；箭头头指示ChR2单阳性细胞。比例尺，20 μm。G，mPFC中ChR2阳性神经元中谷氨酸能和GABA能神经元的分布。H，光遗传学激活后大肠杆菌诱导败血症的实验时间线。小鼠分为两组：ChR2组（光遗传学激活mPFC神经元）和mCherry组（光遗传学对照）。I-N，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测定的血清和脾脏细胞因子水平（n = 6/组）。O，结扎穿刺术（CLP）联合连续7天光遗传学激活的实验设计。P-U，肝（P-Q）、肾（R-S）和肺（T-U）的苏木精-伊红（H&E）染色及组织学评分（n = 6/组）。比例尺，50 μm。数据以均值±标准误（SEM）表示。统计学显著性通过Welch校正的双侧Student's t检验（D，I-N及U）和Holm-?idák校正的多次t检验（Q和S；*P < .05，**P < .01，***P < .001；ns，无显著差异）确定。

大肠杆菌攻击后，与mCherry组相比（n = 6/组），ChR2表达败血症小鼠的促炎细胞因子水平降低，包括TNF-α（血清，89.7 ± 14.3 vs 250 ± 48.5 pg/mL，P = .020；脾脏，75.3 ± 12.8 vs 241 ± 49.1 ng/g，P = .019）和IL-6（血清，2256 ± 426 vs 3622 ± 336 pg/mL，P = .032；脾脏，492 ± 53.6 vs 1465 ± 194 ng/g，P = .003），而IL-10水平无显著差异（血清，310 ± 27.3 vs 403 ± 68.1 pg/mL，P = .250；脾脏，24.2 ± 4.02 vs 47.5 ± 9.94 ng/g，P = .069；图1H-N）。

为进一步探索mPFC中谷氨酸能神经元的激活是否影响组织损伤，使用了CLP模型（另一种败血症小鼠模型）（ChR2组 vs mCherry组，n = 6/组）。H&E染色和组织学评分表明，在败血症期间，与mCherry组相比，ChR2表达小鼠的肝、肾和肺损伤减轻（图1O-U）。（肝脏总评分：2.40 ± 0.14 vs 3.70 ± 0.34，P = .021；肾脏总评分：2.47 ± 0.26 vs 5.27 ± 0.65，P = .024；肺评分：1.22 ± 0.16 vs 2.20 ± 0.25，P = .011）。这些发现表明，mPFC中谷氨酸能神经元的激活通过减轻炎症反应和组织损伤，保护小鼠免受败血症侵害。

**mPFC中谷氨酸能神经元的抑制加重败血症期间的全身性炎症和组织损伤**

我们利用设计性药物激活的受体外受体（DREADDs）通过使用表达工程化Gi偶联hM4Di受体的rAAV2/9抑制mPFC中的神经元活动（图2A）。然后，我们向一组小鼠腹腔注射CNO（5 mg/kg体重）以抑制mPFC中的神经元（图2B）。使用免疫荧光双标记技术，我们发现接受rAAV2/9-hM4Di-EGFP局部注射的小鼠mPFC中，82.6%的hM4Di+细胞为CaMKIIα+兴奋性神经元（图2C-F及补充数字内容，补充图S3，https://links.lww.com/AA/F917）。这些结果表明，在我们的实验条件下，化学遗传学抑制mPFC中的hM4Di+细胞主要抑制了mPFC中的谷氨酸能神经元。

**图2. mPFC化学遗传学抑制加重败血症期间的全身炎症反应和组织损伤。** A，化学遗传学抑制方案示意图。B，重组腺相关病毒（rAAV2/9-hSyn-hM4D(Gi)-EGFP-WPRE-pA）构建体及注射至内侧前额叶皮层（mPFC）。比例尺，0.2 mm。

C，mPFC 的细胞组成。D 和 E，人 muscarinic 受体 4 设计受体仅由设计药物激活，Gi 偶联（hM4Di）与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II α（CaMKIIα）（D）或谷氨酸脱羧酶 67（GAD67）（E）的共定位。箭头指示双阳性细胞；箭头头指示单 hM4Di 阳性细胞。比例尺，20 μm。F，mPFC 中 hM4Di 阳性细胞内的神经元亚型分布。G，化学遗传学抑制后大肠杆菌诱导脓毒症的时间表。小鼠分为两组：hM4Di 组（mPFC 神经元化学遗传学抑制）和 EGFP 组（化学遗传学对照）。H–M，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量的血清和脾脏细胞因子（n = 6/组）。N，化学遗传学抑制后盲肠结扎穿孔（CLP）模型的实验设计。O–T，肝脏（O–P）、肾脏（Q–R）和肺部（S–T）的苏木精 - 伊红（H&E）染色和组织学评分（n = 6/组）。三角形指示细胞丢失区域，黑箭头指示刷状缘丢失。比例尺，50 μm。数据以均值±标准误（SEM）表示。统计学显著性由 Welch 校正的双边 Student's t 检验（H–M 和 T）和 Holm–?idák校正的多次 t 检验（P 和 R）确定（*P < .05, **P < .01, ***P < .001; ns, 无显著性）。

细胞因子分析（图 2G–M）显示，与 EGFP 组相比，表达 hM4Di 的脓毒性小鼠 IL-6 水平升高（血清，6030 ± 153 对 5228 ± 174 pg/mL, P = .006；脾脏，2741 ± 311 对 1385 ± 222 ng/g, P = .006, n = 6/组）。TNF-α 水平在脾脏中升高，但在血清中无显著差异（血清，351 ± 54.0 对 238 ± 27.8 pg/mL, P = .103；脾脏，530 ± 76.7 对 216 ± 27.4 ng/g, P = .008, n = 6/组）。H&E 染色（图 2N–T）显示，当抑制 mPFC 时（hM4Di 组 vs EGFP 组，n = 6/组），肝脏中炎症细胞浸润和出血明显，肾脏中出血更严重、刷状缘丢失和管型，肺部中炎症细胞浸润、间质水肿和血管充血增加。组织学评分显示，与 EGFP 组相比，CLP 诱导的脓毒症导致表达 hM4Di 的小鼠肝脏、肾脏和肺部损伤更严重（肝脏总分：4.57 ± 0.33 对 2.42 ± 0.18, P = .002；肾脏总分：6.28 ± 0.36 对 3.53 ± 0.21, P < .001；肺部评分：2.67 ± 0.21 对 1.87 ± 0.19, P = .018, n = 6/组）。综上所述，我们的结果表明，抑制 mPFC 中的谷氨酸能神经元会加重脓毒症期间的炎症反应和器官损伤。

脓毒症期间 mPFC 对巨噬细胞极化的调节

我们通过流式细胞术分析了脓毒性小鼠脾脏中的免疫细胞，并检测到几个细胞亚群的功能标志物表达发生微小但具有统计学意义的变化（补充数字内容，补充图 S4，https://links.lww.com/AA/F917）。与 EGFP 组小鼠相比，表达 hM4Di 的脓毒性小鼠脾脏单核细胞和巨噬细胞中的 CD80、CD86 和 MHC II 水平升高（图 3A；hM4Di 组 vs EGFP 组；CD80，1168 ± 37.0 对 884 ± 109, P = .047；CD86，8404 ± 660 对 6499 ± 276, P = .034；MHC II，628 ± 46.4 对 440 ± 57.8, P = .036, n = 6/组）。因此，我们假设当免疫系统受到挑战时，mPFC 对巨噬细胞功能有关键作用。

打开多媒体模式

图 3.

打开多媒体模式

mPFC 的抑制或激活驱动巨噬细胞向 M1 或 M2 表型极化。A，脓毒性小鼠化学遗传学抑制后脾脏巨噬细胞的流式细胞术设门策略及标志物表达（CD80、CD86、主要组织相容性复合体 II 类（MHC II））（n = 6/组）。MFI，平均荧光强度。B–E，化学遗传学抑制后，脓毒性增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和人 muscarinic 受体 4 设计受体仅由设计药物激活，Gi 偶联（hM4Di）表达小鼠中 M1 和 M2 脾脏巨噬细胞比例及 M1/M2 比的流式细胞术图和定量（n = 5/组）。小鼠接受氯氮平-N-氧化物（CNO）腹腔内（i.p.）注射，然后再次腹腔内注射 7×10^6 菌落形成单位（CFU）的大肠杆菌。四小时后，采集脾脏。F-I，光遗传学激活后，脓毒性 mCherry 和 channelrhodopsin-2（ChR2）表达小鼠中 M1 和 M2 脾脏巨噬细胞比例及 M1/M2 比的流式细胞术图和定量（n = 5/组）。小鼠接受光遗传学激活，然后腹腔内注射 7×10^6 CFU 的大肠杆菌进行挑战。四小时后，采集脾脏。数据以均值±标准误（SEM）表示。统计学显著性由 Welch 校正的双边 Student's t 检验确定（A, C–E 和 G–I）（*P < .05, **P < .01, ***P < .001; ns, 无显著性）。

为了进一步探索 mPFC 中谷氨酸能神经元的抑制或激活是否影响小鼠对大肠杆菌诱导脓毒症的巨噬细胞极化（n = 5/组），我们通过流式细胞术测量了脾脏中 M1 和 M2 巨噬细胞的比例以及 M1/M2 巨噬细胞的比例（补充数字内容，补充图 S5，https://links.lww.com/AA/F917 和图 3B–I）。我们的结果显示，与 EGFP 组小鼠相比，表达 hM4Di 的脓毒性小鼠脾脏中 F4/80+ CD11b+ CD11c+ M1 巨噬细胞的百分比增加（图 3B, 3C；hM4Di 组 vs EGFP 组，27.9 ± 1.97% 对 19.3 ± 1.73%, P = .011），而 F4/80+ CD11b+ CD206+ M2 巨噬细胞的百分比无显著差异（图 3D；hM4Di 组 vs EGFP 组，15.0 ± 1.39% 对 15.0 ± 1.07%, P > .999）。与 EGFP 组相比，表达 hM4Di 的脓毒性小鼠脾脏中的 M1/M2 巨噬细胞比例增加（图 3E；hM4Di 组 vs EGFP 组，1.89 ± 0.14 对 1.32 ± 0.16, P = .028）。此外，虽然 F4/80+ CD11b+ CD11c+ M1 巨噬细胞的百分比未受影响（图 3G；ChR2 组 vs mCherry 组，22.8 ± 1.05% 对 24.6 ± 1.01%, P = .268），但与 mCherry 组小鼠相比，表达 ChR2 的脓毒性小鼠脾脏中 F4/80+ CD11b+ CD206+ M2 巨噬细胞的百分比增加（图 3F, 3H；ChR2 组 vs mCherry 组，21.4 ± 1.40% 对 16.5 ± 1.14%, P = .026）。与 mCherry 组小鼠相比，表达 ChR2 的脓毒性小鼠脾脏中的 M1/M2 巨噬细胞比例降低（图 3I；ChR2 组 vs mCherry 组，1.08 ± 0.06 对 1.52 ± 0.12, P = .017）。这些结果表明，化学遗传学抑制 mPFC 中的谷氨酸能神经元驱动巨噬细胞在响应脓毒症时向 M1 表型极化。然而，光遗传学激活 mPFC 中的谷氨酸能神经元可能驱动巨噬细胞在响应脓毒症时向 M2 表型极化。

迷走神经介导脓毒症期间 mPFC 依赖的免疫调节

一种神经介导的先天炎症调节的反射形式，即抗炎反射，已被充分研究。25 为了探索 mPFC 中谷氨酸能神经元激活缓解脓毒症全身炎症反应的能力是否由迷走神经介导，随机选择 mCherry 小鼠和 ChR2 小鼠接受左侧颈迷走神经切除术（LcVGX）或假手术（n = 5/组；图 4A）。在假手术小鼠中，脓毒症期间与 mCherry 组相比，ChR2 组的 mPFC 激活降低了 TNF-α 和 IL-6 水平（图 4B–E；血清中 TNF-α，ChR2-sham 对 mCherry-sham，65.9 ± 20.8 对 330 ± 20.6 pg/mL, P < .001；脾脏中 TNF-α，ChR2-sham 对 mCherry-sham，113 ± 36.8 对 283 ± 30.1 ng/g, P = .014；血清中 IL-6，ChR2-sham 对 mCherry-sham，1256 ± 381 对 4946 ± 122 pg/mL, P < .001；脾脏中 IL-6，ChR2-sham 对 mCherry-sham，285 ± 96.4 对 1283 ± 199 ng/g, P = .008）。这些效应在 LcVGX 后消失，ChR2-LcVGX 组与 mCherry-LcVGX 组之间未观察到显著差异。（图 4B–E；血清中 TNF-α，ChR2-LcVGX 对 mCherry-LcVGX，184 ± 35.9 对 289 ± 47.8 pg/mL, P = .219；脾脏中 TNF-α，ChR2-LcVGX 对 mCherry-LcVGX，215 ± 33.7 对 230 ± 24.3 ng/g, P = .924；血清中 IL-6，ChR2-LcVGX 对 mCherry-LcVGX，4511 ± 136 对 4554 ± 110 pg/mL, P = .963。脾脏中 IL-6，ChR2-LcVGX 对 mCherry-LcVGX，691 ± 90.8 对 1083 ± 192 ng/g, P = .204）。这些发现表明，降低促炎因子水平需要完整的迷走神经，因为在单侧 LcVGX 后未发现促炎因子水平降低。

打开多媒体模式

图 4.

打开多媒体模式

mPFC 光遗传学激活在脓毒症中的抗炎作用被左侧颈迷走神经切除术（LcVGX）废除。A，实验方案示意图。光遗传学激活后，通过腹腔内（i.p.）注射 7×10^6 菌落形成单位（CFU）的大肠杆菌诱导小鼠脓毒症，伴或不伴左侧颈迷走神经切除术（LcVGX）。小鼠分为四组：mCherry-sham（光遗传学对照加假手术）、ChR2-sham（mPFC 神经元光遗传学激活加假手术）、mCherry-LcVGX（光遗传学对照加 LcVGX）和 ChR2-LcVGX（mPFC 神经元光遗传学激活加 LcVGX）。四小时后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测量血清和脾脏细胞因子水平，并通过流式细胞术定量脾细胞数量。B–E，通过 ELISA 测量的血清和脾脏细胞因子水平（n = 5/组）。F，脾脏巨噬细胞的流式细胞术图。G 和 H，M2 脾脏巨噬细胞比例和 M1/M2 比的定量（n = 5/组）。数据以均值±标准误（SEM）表示。统计分析使用 Brown–Forsythe 和 Welch ANOVA 及 Dunnett's T3 事后检验（B–E），或普通单因素 ANOVA 及 Tukey's 事后检验（G 和 H）。(*P < .05, **P < .01, ***P < .001; ns, 无显著性)。

此外，我们使用流式细胞术测量了接受 LcVGX 或假手术的 mCherry 表达和 ChR2 表达脓毒性小鼠脾脏中 M2 巨噬细胞的比例和 M1/M2 巨噬细胞比例（n = 5/组）。我们的结果显示，与接受假手术的 mCherry 表达脓毒性小鼠相比，接受假手术的 ChR2 表达脓毒性小鼠中 M2 巨噬细胞的百分比增加，而这一效应在接受 LcVGX 的 ChR2 表达脓毒性小鼠中被废除（图 4F, 4G；M2 巨噬细胞百分比：ChR2-sham 对 mCherry-sham，19.4 ± 0.87% 对 14.4 ± 1.15%, P = .023；ChR2-LcVGX 对 mCherry-LcVGX，14.0 ± 0.89% 对 14.2 ± 1.33%, P > .999）。与接受假手术的 mCherry 表达脓毒性小鼠相比，接受假手术的 ChR2 表达脓毒性小鼠中 M1 对 M2 巨噬细胞的比例降低，而这一效应在接受 LcVGX 的 ChR2 表达脓毒性小鼠中被废除（图 4H；M1/M2：ChR2-sham 对 mCherry-sham，0.793 ± 0.06 对 1.42 ± 0.09, P = .002；ChR2-LcVGX 对 mCherry-LcVGX，1.24 ± 0.11 对 1.16 ± 0.12, P = .920）。总之，这些结果表明，激活 mPFC 中的谷氨酸能神经元可减轻脓毒症诱导的炎症反应和器官损伤，且该作用与迷走神经介导的巨噬细胞向 M2 表型极化有关。

ADRB2 和脾神经介导 mPFC 依赖的免疫调节

为了鉴定 mPFC 中谷氨酸能神经元化学遗传学抑制后脓毒性小鼠脾脏中免疫反应的变化，我们分离了用大肠杆菌挑战的 hM4Di 表达小鼠和 EGFP 表达小鼠的脾脏，并进行了 RNA 测序。我们进行了基因本体论（GO）富集分析以识别关键差异表达基因（DEGs），结果显示 DEGs 最显著富集在吞噬作用和先天免疫反应等 GO 术语中（补充数字内容，补充图 S6A，https://links.lww.com/AA/F917）。我们在表达 hM4Di 的脓毒性小鼠样本和表达 EGFP 的脓毒性小鼠样本之间鉴定了 639 个 DEGs（FDR < 0.05 和 FC 2.0；补充数字内容，补充图 S6B，https://links.lww.com/AA/F917）。热图中的九个基因是主要的肾上腺素能受体亚型，其中 Adrb2 的表达最高（图 5A）。Adrb2 基因编码β2-肾上腺素能受体（ADRB2），参与免疫反应。

在表达hM4Di的脓毒症小鼠中，脾脏中Adrb2的相对表达量与表达EGFP的脓毒症小鼠相比显著升高（hM4Di vs EGFP，1.87 ± 0.21 vs 1.00 ± 0.11，P = .011，n = 5/组；图5B）。这些结果表明，在脓毒症期间，内侧前额叶皮层（mPFC）谷氨酸能神经元与脾脏免疫反应之间的功能联系可能由ADRB2介导。图5.化学遗传学抑制mPFC诱导的脓毒症免疫反应加剧涉及β2肾上腺素受体（ADRB2）信号通路和脾神经。A，通过RNA测序（RNA-seq）测定的脾脏神经递质受体表达热图（n = 3/组）。B，化学遗传学抑制条件下脓毒症小鼠脾脏β2肾上腺素受体（Adrb2）表达的定量聚合酶链反应（qPCR）分析（n = 5/组）。C，化学遗传学抑制后脓毒症小鼠流式细胞术分析的实验设计，使用ICI-118,551（ADRB2拮抗剂，2 mg/kg，腹腔注射）或6-羟多巴胺（6-OHDA；提前1周给予）。小鼠分为六组：EGFP-生理盐水、hM4Di-生理盐水、EGFP-ICI-118,551、hM4Di-ICI-118,551、EGFP-6-OHDA和hM4Di-6-OHDA。D，脓毒症小鼠脾脏巨噬细胞的流式细胞术图谱。E和F，M1脾巨噬细胞比例和M1/M2比值定量（n = 4/组）。数据以均值±标准误（SEM）表示。统计学显著性通过Welch校正的双侧Student's t检验（B）以及Brown–Forsythe和Welch方差分析结合Dunnett's T3事后检验（E和F）确定。（*P < .05，**P < .01，***P < .001；ns，无显著性差异）

我们使用ICI-118,551，一种ADRB2特异性拮抗剂，来抑制脾脏中ADRB2的作用，或给予6-OHDA诱导脾神经去神经化（图5C）。我们的结果显示，与生理盐水处理的表达EGFP的脓毒症小鼠相比，生理盐水处理的表达hM4Di的脓毒症小鼠中M1巨噬细胞百分比升高，而这一效应在ICI-118,551处理或6-OHDA处理的表达hM4Di的脓毒症小鼠中消失（图5D、5E；M1巨噬细胞百分比：hM4Di-生理盐水 vs EGFP-生理盐水，30.8 ± 1.71% vs 23.0 ± 1.06%，P = .030；hM4Di-ICI-118,551 vs EGFP-ICI-118,551，20.9 ± 2.04% vs 21.6 ± 2.14%，P = .992；hM4Di-6-OHDA vs EGFP-6-OHDA，26.3 ± 3.00% vs 26.2 ± 2.34%，P > .999，n = 4/组）。与生理盐水处理的表达EGFP的脓毒症小鼠相比，生理盐水处理的表达hM4Di的脓毒症小鼠中M1与M2巨噬细胞比值升高，而这一效应在ICI-118,551处理或6-OHDA处理的表达hM4Di的脓毒症小鼠中消失（图5F；M1/M2：hM4Di-生理盐水 vs EGFP-生理盐水，2.75 ± 0.32 vs 1.39 ± 0.11，P = .039；hM4Di-ICI-118,551 vs EGFP-ICI-118,551，1.41 ± 0.13 vs 1.65 ± 0.10，P = .139；hM4Di-6-OHDA vs EGFP-6-OHDA，1.74 ± 0.28 vs 1.34 ± 0.19，P = .588，n = 4/组）。这些结果表明，mPFC谷氨酸能神经元抑制在脓毒症反应中驱动巨噬细胞向M1表型极化的效应可能由脾脏中ADRB2和脾神经介导。

通过ADRB2传递信号的主要神经递质是NE。我们进行了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）来测定分泌的NE水平。我们的结果显示，表达EGFP的脓毒症小鼠与表达hM4Di的脓毒症小鼠之间血浆或脾脏NE水平无统计学显著差异（n = 5/组），表达mCherry的脓毒症小鼠与表达ChR2的脓毒症小鼠之间血浆或脾脏NE水平也无统计学显著差异（n = 5/组；血浆去甲肾上腺素：hM4Di vs EGFP，286 ± 40.3 vs 281 ± 16.8 ng/mL，P = .994；ChR2 vs mCherry，320 ± 27.5 vs 322 ± 20.3 ng/mL，P > .999；脾脏去甲肾上腺素：hM4Di vs EGFP，569 ± 65.3 vs 514 ± 30.0 ng/mL，P = .707；ChR2 vs mCherry，614 ± 56.1 vs 615 ± 97.6 ng/mL，P > .999；补充数字内容，补充图S7，https://links.lww.com/AA/F917）。综上所述，我们的结果表明，mPFC调节脓毒症小鼠免疫反应的机制可能涉及脾脏中ADRB2表达的改变，而非NE总水平的变化。

讨论

本研究确立mPFC中的兴奋性谷氨酸能神经元是脓毒症期间外周免疫反应的关键调节因子。与我们的假设一致，这些神经元通过自主神经通路（包括迷走神经和脾神经）发挥免疫调节作用，并通过ADRB2信号通路作用于脾脏巨噬细胞，从而调节巨噬细胞极化及后续炎性细胞因子的释放。总体而言，我们的发现揭示了一种此前未被认识的中枢神经环路双向神经免疫调节机制，为理解脓毒症中的神经免疫相互作用和推进治疗策略提供了概念框架。

既往多项功能神经影像学研究已确定了与人类外周炎症相关的脑区，多水平核密度分析显示在杏仁核、中脑和前额叶皮层中有一致效应1?。此外，腹侧被盖区（奖赏系统的关键组成部分）的激活可增强免疫宿主防御系统2?。近期研究证明杏仁核控制可被行为调节的体液免疫反应2?。我们之前的研究发现，选择性激活基底前脑胆碱能神经元可通过副交感神经减轻脓毒症期间的脾脏促炎反应，但未进一步研究涉及的关键细胞和机制21。此外，随着高分辨率免疫组织化学和立体学方法的发展，解剖学证据表明基底前脑胆碱能神经元投射至mPFC2?。我们使用免疫荧光分析即时早期基因编码的c-Fos蛋白的表达2?，发现mPFC中的神经元被脓毒症激活。本研究进一步证明mPFC调节外周免疫，并对其潜在机制进行了系统性调查。

自主神经系统在炎症的发生、进展和消退中发挥重要作用3??31。在本研究中，我们发现mPFC谷氨酸能神经元的激活显著降低脾脏和血液中的促炎因子水平。此外，我们发现mPFC谷氨酸能神经元的激活显著增加M2巨噬细胞数量并降低M1/M2巨噬细胞比值，而这些效应在缺乏迷走神经时被逆转。总体而言，这些结果表明，当mPFC谷氨酸能神经元被激活时，副交感通路的激活可减轻脓毒症期间的全身炎症反应和器官损伤。这一结论与既往研究报告的迷走神经介导的反射通过抑制脾脏中促炎因子的产生来调节感染和损伤期间的免疫反应一致2??32。

脾脏中免疫细胞上神经递质受体的表达模式提示免疫反应存在分层神经调控33。我们使用RNA测序和qPCR评估脾脏中神经递质受体的表达，发现化学遗传学抑制mPFC谷氨酸能神经元后，表达hM4Di的脓毒症小鼠中ADRB2表达显著升高。然而，血浆和脾脏去甲肾上腺素（NE）水平未发生显著改变。这些发现提示mPFC抑制可能主要通过增加ADRB2表达或受体反应性来增强肾上腺素能免疫信号，而非通过整体增加NE释放。由于NE水平是在血浆和整个脾脏匀浆中测量的，这些数据可能无法完全反映脾神经末梢局部或神经免疫微环境中的神经递质动态。因此，6-OHDA诱导的脾去神经化逆转巨噬细胞极化可能反映了脾神经完整性和局部神经-免疫信号的参与，而非NE总量的变化。

NE激活ADRB2，后者可通过经典或非经典通路抑制或增强免疫反应和炎症3??3?。在经典通路中，ADRB2介导的巨噬细胞免疫功能抑制涉及腺苷酸环化酶和蛋白激酶A的激活，导致炎症反应受抑3?。相反，非经典ADRB2信号可能通过细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）激活和TNF-α产生增加来增强巨噬细胞的炎症活性3??3?。在本研究中，化学遗传学抑制mPFC谷氨酸能神经元加剧了脓毒症期间的炎症反应和器官损伤，并增加了脾脏巨噬细胞的M1极化。这些效应被ADRB2的药理学阻断所逆转，表明ADRB2信号通路有助于mPFC抑制诱导的促炎效应。基于脾脏ADRB2表达升高和ICI-118,551逆转巨噬细胞极化的结果，我们推测非经典ADRB2信号通路可能参与了这一过程。然而，由于未直接检测下游信号分子（如磷酸化ERK1/2），该机制仍需进一步验证。

在脾脏中，ADRB2在巨噬细胞以及T细胞、B细胞和树突状细胞上广泛表达3?。在各种免疫疾病中，ADRB2对不同免疫细胞类型产生矛盾效应3??3?。鉴于这一广泛的表达模式，我们试图确定在脓毒症期间mPFC介导的ADRB2信号主要靶向哪些脾脏免疫细胞群体。使用流式细胞术和t-SNE分析，我们检测了巨噬细胞、树突状细胞和B细胞上功能标志物表达的变化。虽然ADRB2也表达于T细胞、B细胞和树突状细胞，但我们的分析显示mPFC调节主要影响脾脏巨噬细胞：我们观察到巨噬细胞上功能标志物表达有适度但统计学显著的改变，而表达hM4Di的脓毒症小鼠与表达EGFP的对照组相比，脾脏中树突状细胞或B细胞上功能标志物表达未见显著差异。综上所述，这些结果表明mPFC主要通过脾脏巨噬细胞而非树突状细胞或B细胞调节脓毒症期间的外周免疫反应。

经颅磁刺激（TMS）是一种新的诊断和治疗技术，可激活或抑制前额叶皮层。由于其无创且耐受性良好，具有高的空间准确性、安全性和可靠性，TMS已被广泛应用于临床实践??。该技术可能使mPFC的调节成为可能，从而在脓毒症等严重感染性疾病中调控外周免疫。这里在脓毒症小鼠中的发现与既往影像学和人体试点研究描述TMS临床效应的结果一致，可能为TMS技术的发展提供潜在的转化方向，并凸显了应用TMS刺激mPFC兴奋性神经元以减轻脓毒症的巨大前景。

我们的研究存在若干局限性。首先，mPFC含有谷氨酸能和GABA能神经元。虽然光遗传学和化学遗传学方法表明激活mPFC谷氨酸能神经元可减轻脓毒症诱导的炎症反应和器官损伤，但这些效应能否外推至人类仍不清楚。mPFC中其他神经元亚型和微小胶质细胞的潜在作用也有待进一步研究。其次，虽然我们的发现提示ADRB2信号通路的参与，但下游信号分子如磷酸化ERK1/2未被直接检测；因此，所提出的机制需要进一步验证。第三，NE水平仅在血浆和整个脾脏匀浆中测量，这可能无法完全反映脾神经末梢局部或神经免疫微环境中的神经递质动态。第四，仅使用雄性小鼠以避免动情周期变异，动情周期对雌性脓毒症影响的潜在机制有待进一步研究。最后，由资源方程法确定的样本量主要提供了检测大效应量的足够效能。因此，我们的研究并非旨在检测小或中等差异，无显著结果的次要结局应据此解读。

利益冲突：无。资金：无。本稿件由Christina Pabelick, MD处理。

致谢

我们感谢浙江大学医学院核心设施李燕伟女士和方三华先生提供的技术支持。