《ACS Central Science》：Correction to “Mapping Protein–Protein Interactions at Birth: Single-Particle Cryo-EM Analysis of a Ribosome–Nascent Globin Complex”
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文章发表后，研究团队识别出已发表文本中的少量不准确之处，以及已发表的单颗粒冷冻电镜（sp-cryo-EM）结构中的轻微错误，相关更正在此提供。此外，还实施了一些补充内容，以用蛋白质印迹法（Western blotting）补足原有的SDS-PAGE分析。由此，
文章发表后，研究团队识别出已发表文本中的少量不准确之处，以及已发表的单颗粒冷冻电镜（sp-cryo-EM）结构中的轻微错误，相关更正在此提供。此外，还实施了一些补充内容，以用蛋白质印迹法（Western blotting）补足原有的SDS-PAGE分析。由此，独立于sp-cryo-EM的额外证据进一步支持了新生脱辅基肌红蛋白（apoMb）与大肠杆菌（E. coli）核糖体蛋白L23和L29之间存在相互作用。为完成此处提出的补充与更正，研究团队新增了两位共同作者（Neomi Millan和Joyati Das）。以下是相关更正与补充的详细描述。
针对原始文章图1d的SDS-PAGE图像，部分分子量（M.W）标准标注有误，正确的分子量标签现已显示于图1d中。在原始文章的“结果与讨论”部分（第388页第4行），L29核糖体蛋白的分子量曾被错误列为15.8 kDa，正确分子量为7.3 kDa。因此，第388页（第4–5行）的文本应更正为：“r-蛋白的相应大小分别为11.2 kDa和7.3 kDa。鉴于这两个数值之和为18.5 kDa。”
在审查本工作中报告的脱辅基肌红蛋白（apoMb）核糖体新生链（RNC）复合物的冷冻电镜密度图时，研究人员意识到曾意外地将8个残基中的2个错误归属为apoMb新生链（位于核糖体外表面），而非L23核糖体蛋白（r-蛋白）的C末端。这一不准确之处现已修正，图4d和图4e的图像也已更新。
对sp-cryo-EM结构的重新精修导致支持信息表S1–S3中结构验证参数发生微小变化，这些表现已更新为最终正确数值。
为确保对涉及RNCs的相互作用进行更完整的、不依赖冷冻电镜（cryo-EM）的表征，研究团队在零长度交联剂EDC存在的情况下进行了蛋白质印迹数据采集，结果如图1的新面板e和f所示。这些补充数据进一步支持了apoMb新生链与位于核糖体外表面出口通道附近的L23和L29核糖体蛋白的邻近性。该结果独立于cryo-EM，与主论文中报道的apoMb新生链sp-cryo-EM结构分析完全一致。
与已发表的空核糖体结构（见图4f、g、h）的比较表明，在空核糖体冷冻电镜结构模型（PDBID: 7K00）中，L23 r-蛋白Leu93之后的C末端残基呈无序状态，因此无法检测。然而，L23 C末端Leu93之后的残基在研究人员解析的结构（PDBID: 9ZTL）中是可识别的，这表明新生链降低了L23 C末端的动态性。此外，原始图4中的面板标签（a、b、c等）缺失，现已在修正后的图4中明确标出。最后，apoMb-RNC/核糖体复合物的三维结构现已存入RCSB蛋白质数据库（PDB），登录号为9ZTL，并存入电子显微镜数据库（EMDB），登录号为EMD-74757。
针对大肠杆菌L23和L29核糖体蛋白的兔多克隆抗体由Genscript（新泽西州皮斯卡塔韦）制备。抗L23抗体是针对CGKVKRHGQRIGRRS表位产生的，该肽段对应大肠杆菌L23核糖体蛋白的第65至78位氨基酸。此类抗体（即针对相同L23表位的抗体）已在先前研究中得到验证。两种独立的抗L29抗体分别针对MKAKELREKSVEELC和CVARVKTLLNEKAGA表位产生，分别对应大肠杆菌L29核糖体蛋白的第1至14位和第50至62位氨基酸。注意，根据主论文及本文报道的sp-cryo-EM结构，这些表位位于L29中不与apoMb新生链相互作用的区域。抗L29抗体通过在不存在EDC交联剂的情况下，对携带apoMb新生链的纯化大肠杆菌核糖体样品进行蛋白质印迹验证。所得SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹如图1f所示。如预期，检测到对应于游离L29（7.3 kDa）的单一条带。为排除抗L29抗体任何潜在的交叉反应性，使用EMBOSS Water成对局部序列比对工具，将两个L29肽段表位与所有大肠杆菌50S亚基核糖体蛋白进行了比较。该软件采用Smith-Waterman算法。支持信息表S6和S7显示，大多数50S核糖体蛋白的序列与两个L29表位的序列差异显著，支持了对抗L29抗体特异性的验证。另一方面，少数核糖体蛋白显示高达64%的序列同一性和高达78%的序列相似性。观察到与核糖体蛋白L4的相似性最高。然而，该蛋白的分子量与L29差异很大，因此不太可能解释图1f中在L29预期分子量处观察到的条带。鉴于潜在的抗体交叉反应性对于在SDS-PAGE中共同迁移的蛋白质最为相关，研究人员对分子量与L29相似的核糖体蛋白给予了额外关注。其中，少数核糖体蛋白相对于L29表位显示出的整体序列同一性和相似性分别为50%和57%（支持信息表S6和S7）。但重要的是，这些值远低于L29表位的100%同一性值。此外，未发现这些蛋白质存在延伸的连续匹配。此外，还针对所有30S亚基核糖体蛋白进行了序列比对。30S蛋白均不具有与L29相当的分子量。综上所述，上述序列比对数据和图1f的低分子量印迹条带支持了抗L29抗体对大肠杆菌L29核糖体蛋白的特异性。
N末端BODIPY-FL标记的apoMb RNCs通过大肠杆菌无细胞转录-翻译生成，如主论文所述，在不存在或存在EDC交联剂（L23为80 mM EDC，L29为25 mM）的条件下进行。随后通过低pH SDS-PAGE分析样品，并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。膜用5%（w/v）脱脂奶粉（Bio-Rad）封闭，并在室温下与针对大肠杆菌L23（1:1,000稀释）或大肠杆菌L29（1:500稀释）的兔多克隆抗体在轻轻摇晃的平台上孵育过夜。用含0.05%（v/v）Tween 20的三缓冲盐溶液（TBST）洗涤后，将膜与AlexaFluor-Plus-647偶联的山羊抗兔二抗（Thermo Fisher；1:10,000稀释）在室温下孵育45分钟。最后，在荧光成像仪（GE Typhoon FLA 9500）上以635 nm激发，使用长通（LPR）滤波器检测荧光发射强度。
**论文解读：核糖体新生链相互作用的结构与生化验证——基于单颗粒冷冻电镜的更正与补充研究**
**一、研究背景与意义**
蛋白质生物合成过程中，新生多肽链在核糖体出口通道附近折叠并与其他生物大分子发生相互作用。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions, PPI）是细胞功能的核心执行基础。核糖体新生链复合物（ribosome-bound nascent chain complex, RNC）的相互作用，发生在新生成蛋白质“诞生”之际，对其后续折叠和功能执行具有重要意义。单颗粒冷冻电镜（single-particle cryo-electron microscopy, sp-cryo-EM）技术能够在近原子分辨率下解析核糖体-新生链复合物的三维结构，为描绘蛋白质相互作用提供重要的结构基础。本论文针对已发表的关于脱辅基肌红蛋白（apomyoglobin, apoMb）新生链与核糖体蛋白L23和L29相互作用的研究进行了系统性更正与补充。原研究中存在若干分子量标注错误、结构模型残基归属错误等问题，为严谨性考虑，研究团队对原稿进行了全面的修订，并通过独立于sp-cryo-EM的生物化学证据进一步验证了结构生物学结论。
**二、研究内容与结论**
研究人员采用多方法互补策略，对apoMb RNC与核糖体蛋白L23和L29的相互作用进行了重新验证。主要得出以下结论：（1）原图中L29核糖体蛋白的分子量标注存在错误，正确数值应为7.3 kDa，该更正涉及图1d及相应正文描述；（2）在sp-cryo-EM结构解析中，原研究将L23核糖体蛋白C末端的2个残基错误归属为新生链残基，经重新精修后纠正了该错误，并建立了正确的原子模型；（3）通过Western blotting这一独立于sp-cryo-EM的生物化学方法，研究进一步证实apoMb新生链与L23和L29核糖体蛋白之间的邻近关系；（4）通过对比空核糖体结构（PDBID：7K00）与含新生链复合物结构（PDBID：9ZTL），发现新生链的存在降低了L23蛋白C末端的动态性，使其在Leu93之后的残基在结构中可被识别。该研究发表于《ACS Central Science》。
**三、主要关键技术方法**
研究人员主要使用了以下关键实验技术：（1）单颗粒冷冻电镜（sp-cryo-EM）技术，用于解析apoMb RNC/核糖体复合物的三维结构，分辨率足以区分氨基酸残基的归属；（2）零长度交联剂EDC处理，用于固定新生链与核糖体蛋白之间的邻近相互作用；（3）低pH SDS-PAGE结合蛋白质印迹法（Western blotting），用于生化验证蛋白质相互作用；（4）基于EMBOSS Water软件的Smith-Waterman算法进行序列比对分析，用于验证抗体的特异性；（5）兔多克隆抗体制备技术，针对L23和L29核糖体蛋白的特异性表位免疫获得抗体。其中，apoMb RNCs通过大肠杆菌无细胞转录-翻译系统生成。抗体由Genscript公司（美国新泽西州）制备。
**四、研究结果**
**4.1 SDS-PAGE分析的更正**
原始文章图1d中部分分子量标准标注有误。经更正后，L29核糖体蛋白的分子量被正确标注为7.3 kDa（原误标为15.8 kDa），而L23核糖体蛋白对应为11.2 kDa，应更正正文中的描述为“r-蛋白的相应大小分别为11.2 kDa和7.3 kDa。鉴于这两个数值之和为18.5 kDa。”该更正明确了SDS-PAGE凝胶上各条带的正确归属。
**4.2 sp-cryo-EM结构的重新精修**
通过细致的密度图审查，研究人员意识到在原始结构模型中，有2个氨基酸残基被错误归属于apoMb新生链而非核糖体蛋白L23的C末端。经重新优化处理后，结构模型已修正。重新精修导致结构验证参数发生微小变化，支持信息中的表S1–S3已相应更新。修正后的结构显示，apoMb新生链密度与核糖体外表面靠近出口通道的L23和L29蛋白相互作用，这一观察与图4中更新的结构模型一致。
**4.3 Western blotting验证新生链与L23和L29的相互作用**
为提供不依赖sp-cryo-EM的独立证据，研究人员引入了Western blotting分析。在EDC交联剂存在条件下，通过抗L23和抗L29特异性抗体对apoMb RNCs样品进行检测。结果显示，apoMb新生链与L23和L29核糖体蛋白存在共迁移或交联产物，进一步支持新生链与这两种核糖体蛋白在空间上的邻近关系。该结果与sp-cryo-EM结构分析完全一致，为结构发现提供了生物化学层面的独立佐证。
**4.4 新生链对L23蛋白C末端动态性的影响**
通过比较空核糖体（PDBID：7K00）与含apoMb新生链的复合物（PDBID：9ZTL）结构，研究人员发现：L23核糖体蛋白在空核糖体中，C末端Leu93之后的残基处于无序状态而不可检测；但在含有新生链的结构中，L23 C末端Leu93之后的残基清晰可辨，表明新生链的结合显著降低了L23蛋白C末端的构象动态性。这一结果为理解核糖体蛋白如何参与新生链的协同折叠提供了新的结构见解。
**4.5 抗L23和抗L29抗体的生成与特异性验证**
为支持Western blotting实验，研究团队针对大肠杆菌L23和L29核糖体蛋白的特定表位制备了兔多克隆抗体。L23抗体针对第65至78位氨基酸残基的CGKVKRHGQRIGRRS肽段；L29抗体分别针对第1至14位和第50至62位氨基酸残基的MKAKELREKSVEELC和CVARVKTLLNEKAGA肽段。序列比对分析显示，这两个L29表位与50S核糖体蛋白的大多数序列差异显著，但少数蛋白（如L4）存在最高达64%的序列同一性和78%的序列相似性。但由于L4蛋白分子量与L29差异较大，在SDS-PAGE中不会干扰目标条带的识别。30S亚基蛋白中则无分子量与L29相近的蛋白。该验证结果支持了抗体的特异性。
**五、讨论与结论**
本研究讨论部分强调了sp-cryo-EM结构解析中残基归属准确性的重要性。原始解析中L23蛋白C末端残基被错误归属为新生链，这一修正不仅纠正了模型中的局部错误，也揭示了核糖体蛋白L23 C末端在与新生链相互作用时的构象行为：该区域在无新生链时呈高度动态性而不可见，而在新生链存在时则变得稳定有序。以上观察表明L23蛋白的C末端可能在新生链穿出核糖体出口通道时发挥了稳定化作用。研究结论为：apoMb新生链在核糖体表面与r-蛋白L23和L29发生直接相互作用，新生链的存在降低了L23蛋白C末端的动态性，修正后的结构模型已分别以PDBID：9ZTL和EMD-74757存入蛋白质数据库（RCSB PDB）和电子显微镜数据库（EMDB）。
