《ACS Applied Bio Materials》：A Pluronic F127/Carbopol 974P Nanogel Provides a Water-Dispersible Formulation of Duguetia stelechantha Essential Oil for Developmental Safety Assessment in Zebrafish Embryos
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聚合物纳米凝胶（polymeric nanogels）是制备包括精油（essential oils）在内的疏水性生物活性化合物水分散液的极具吸引力的生物材料平台。然而，将化学组成复杂、富含萜烯的精油掺入这些聚合物系统可能会改变其超分子组织、胶体行为和生物响应。
聚合物纳米凝胶（polymeric nanogels）是制备包括精油（essential oils）在内的疏水性生物活性化合物水分散液的极具吸引力的生物材料平台。然而，将化学组成复杂、富含萜烯的精油掺入这些聚合物系统可能会改变其超分子组织、胶体行为和生物响应。此类理化变化本身并不能证明具有控释性能或定量递送效果。本研究开发并表征了一种掺入标称浓度1%（w/w）Duguetia stelechantha精油微滴（essential oil droplets，EODs）的Pluronic F127/Carbopol 974P纳米凝胶，并使用斑马鱼（Danio rerio）胚胎作为脊椎动物筛选模型评价了完整制剂的发育安全性特征。化学分析表明，EODs的主要成分为桧烯（sabinene，41.44%）、萜品烯-4-醇（terpinen-4-ol，17.61%）和斯巴醇（spathulenol，9.21%）。优化后的EODs掺入纳米凝胶（nGDs）提供了疏水性油的均匀水分散液，而傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热法（DSC）、动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）揭示了制剂依赖性的光谱行为、热转变、流体动力学参数、干燥样品形态和表观纳米力学性能差异。这些差异与非共价缔合和聚合物组织变化相一致，但并不能确定分子定位或特定的自组装机制。标称含油量不应被解释为实验测定的包封效率或分析载药量。暴露于50–200 μg mL–1的nGDs诱导了浓度依赖性的发育毒性，包括死亡率增加、孵化改变、自发尾部卷曲减少、心脏损伤和形态学异常。相比之下，无油的聚合物基质并未重现nGDs观察到的毒性特征，表明载体本身并不能解释完整制剂诱导的不良反应。这些发现表征了nGDs作为一种无需添加有机助溶剂或其他外部分散载体的水可分散生物应用制剂的发育安全性特征。由于缺乏游离EODs对照，结果无法确定制剂是否改变了精油的内在毒性。
**论文解读：Pluronic F127/Carbopol 974P纳米凝胶负载Duguetia stelechantha精油的发育安全性评价——基于斑马鱼胚胎模型的研究**
**研究背景与目的**
聚合物纳米凝胶（polymeric nanogels）因其高含水量、可调控的超分子组织以及容纳疏水性分子的能力，已成为制备疏水性生物活性化合物水分散液的重要生物材料平台。Pluronic F127（poloxamer 407）凭借其两亲性PEO–PPO–PEO嵌段结构，可自组装形成胶束及凝胶样结构，而Carbopol 974P可贡献基质结构化与物理稳定作用，二者组合在疏水性药物递送领域具有广泛应用前景。然而，聚合物的广泛药用历史并不能保证每种F127体系均具有相同的安全性特征——生物响应取决于聚合物浓度、物理状态、所载功能组分、制剂架构、暴露时长及所采用的生物学模型。
精油（essential oils，EOs）是化学组成复杂的天然产物，其富含的单萜与倍半萜可作用于生物膜并调节细胞功能。Duguetia stelechantha（Annonaceae）的精油（EODs）具有富含萜烯的组成和先前报道的抗利什曼原虫活性，但其疏水性和较差的水分散性限制了其在不添加有机助溶剂条件下的直接生物学应用。已有研究表明，将化学组成复杂的天然产物精油掺入聚合物系统可能改变其组织结构和生物学行为，但关于萜烯类精油如何影响Pluronic/Carbopol体系的超分子组织及整体生物响应，目前信息有限。斑马鱼（Danio rerio）胚胎因其光学透明、发育快速、体积小且脊椎动物生理学保守，被选为早期全生物体脊椎动物危害识别模型。本研究旨在开发并表征负载D. stelechantha精油的Pluronic F127/Carbopol 974P纳米凝胶（nGDs），并利用斑马鱼胚胎-幼鱼模型评价完整制剂的发育安全性特征，以区分完整制剂与无油聚合物基质（P）的生物响应差异。
**研究内容与结论概述**
研究人员制备了含标称浓度1%（w/w）EODs的Pluronic F127/Carbopol 974P纳米凝胶（nGDs）及对应无油聚合物制剂（P），通过化学表征、理化性质分析及多终点胚胎-幼鱼生物学评价，系统考察了完整水分散制剂的发育毒性特征。结果表明，nGDs在50–200 μg mL
–1浓度范围内诱导了浓度依赖性的死亡率增加、孵化抑制、自发尾部卷曲频率降低、心率改变及多种形态学异常；而无油聚合物基质P在相同条件下未重现该毒性特征，表明载体本身不构成主要毒性来源。该研究为含精油聚合物纳米凝胶的安全导向开发提供了制剂特异性的全生物体危害识别数据。
**关键技术方法**
研究采用水蒸气蒸馏法提取EODs，利用气相色谱-质谱联用（GC–MS）和气相色谱-火焰离子化检测（GC–FID）进行化学组成分析，以NIST谱库和线性保留指数（LRI）鉴定化合物。制剂理化表征综合运用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热法（DSC）、动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）。生物学评价按OECD TG 236指南进行，采用斑马鱼胚胎急性毒性试验框架并延长暴露至144 h，涵盖死亡率、孵化率、自发尾部卷曲频率（SCF）、心率及形态学异常等多终点评估。植物材料采集自巴西马拉尼昂州Baixada Maranhense地区（SISGEN AA3D4EE），凭证标本（SLUI 005612）存放于Rosa Mochel植物标本馆。实验所用成年斑马鱼（AB品系）饲养于UFG多用户动物生产与实验中心。
**研究结果**
**3.1 提取率与EODs化学表征（GC–MS与GC–FID）**
EODs的提取率为1.07%，与Duguetia属常见范围一致。化学分析共鉴定出38种化合物，占总色谱组成的97.67%。单萜为主导成分（83.11%），倍半萜占14.56%。主要化合物为桧烯（sabinene，41.44%）、萜品烯-4-醇（terpinen-4-ol，17.61%）和斯巴醇（spathulenol，9.21%），另有γ-松油烯（3.08%）、p-伞花烃（3.70%）、α-蒎烯（2.27%）等。该化学型与Annonaceae科其他物种的报道一致。需注意，本研究将EODs作为化学复杂混合物整体评价，未对单一组分进行毒性归因。
**3.2 纳米凝胶制剂的开发、初步稳定性筛选与理化表征**
初步制剂筛选表明，标称EODs浓度0.125–1%（w/w）的体系在离心及14天热循环后保持宏观均匀，无可见相分离；而高于该范围的体系出现不稳定。含1%（w/w）标称EODs的制剂（nGDs）作为最高含油量且保持宏观均匀的系统被选择用于后续表征。该值仅为制备时添加量，不代表包封效率或载药量。
FTIR显示nGDs与P在C–O–C伸缩区（1105–1060 cm
–1）、CH
2伸缩带及O–H区域存在谱带差异，提示EODs掺入改变了聚合物基质的局部化学环境，但未检测到新共价键。DSC热谱显示nGDs相对P在主热事件强度和模式上发生变化，表明EODs影响了聚合物制剂的熱行为。DLS分析显示P在25 ℃至37–45 ℃范围内平均流体力学直径从661 ± 6 nm降至约17 nm，而nGDs直径在270 ± 73至208 ± 10 nm之间波动，二者呈现不同的温度依赖性流体力学行为；nGDs在32 ℃和37 ℃的多分散指数（PDI）分别为0.44和0.42，分布较宽。SEM观察nGDs干燥样品呈现较致密区域和平滑表面。AFM定量纳米力学分析显示P的表观DMT模量为10.74 ± 2.28 MPa，nGDs为12.91 ± 8.85 MPa；粘附力分别为16.78 ± 6.16 nN和3.23 ± 3.38 nN。这些结果共同表明EODs掺入导致制剂依赖性差异，但各技术均不能直接确定EODs组分的分子定位或特定自组装机制。
**3.3 斑马鱼胚胎-幼鱼的发育生物学响应**
**3.3.1 死亡率与孵化**
暴露于nGDs后，斑马鱼胚胎和幼鱼出现明确的浓度依赖性死亡率增加。C1（50 μg mL
–1）和C2（100 μg mL
–1）在144 hpe时死亡率分别约为36.66%和40%，C3（200 μg mL
–1）表现出更早的起效和更陡的进程。毒性发生的24–48 hpe时间窗对应心脏功能建立、循环启动、体节成熟和神经肌肉活动确立的关键发育阶段。相比之下，阴性对照（NC）和无油聚合物基质P在整个暴露期间死亡率可忽略不计，表明载体本身不能解释nGDs的致死效应。孵化方面，C1显著延迟孵化（p = 0.0004），C2和C3完全抑制孵化（p < 0.0001），效应接近阳性对照（PC）水平。
**3.3.2 神经毒性**
24 hpe的自发尾部卷曲频率（SCF）评估显示，C2暴露组胚胎尾部卷曲完全抑制，表明早期神经肌肉活动受到显著干扰；C1组SCF与阴性对照相当。SCF是早期神经发育的敏感生物标志物，其抑制应被视为暴露于完整nGDs制剂的上位响应。由于本研究未单独评价游离EODs或分离组分，不能将效应归因于特定萜烯化合物。
**3.3.3 心脏毒性**
48 hpe心率测定表明，无油聚合物基质P仅较阴性对照略有降低。与之相比，暴露于含EODs完整制剂的C2组表现出更明显的心脏响应，心率较对照组降低，呈浓度依赖性趋势。C3组因分析时已完全死亡而无法评估心脏活动。文献曾报道部分单萜可调节离子通道和心脏电生理，但本研究中钙内流、离子通道活性、氧化应激等机制均未测定，该结果应视为完整制剂暴露诱导的上位心脏终点。
**3.3.4 致畸性**
形态学评估显示，C1组出现心包水肿（PE）、卵黄囊水肿（YSE）、小眼症和颅面改变的发病率增加；C2和C3组效应更频繁且严重，包括脊柱前凸、尾部畸形、出血和颅面缺损。无油聚合物P仅产生轻微且罕见的畸形，未重现nGDs的形态学响应模式。这些结果表明完整制剂在测试条件下影响了多个发育系统，但潜在的细胞通路未予确定。
**讨论与结论**
本研究的核心科学贡献不在于Pluronic F127/Carbopol 974P基质本身——该基质已是成熟的制剂平台——而在于提供了负载EODs的完整Pluronic F127/Carbopol 974P体系在脊椎动物模型中的制剂特异性发育危害特征，并采用了相应的无油聚合物基质作为对照。研究整合了致死、发育、神经行为、心脏和形态学终点，证明载体单独不能解释完整制剂诱导的不良反应。
然而，该研究明确未建立控释性能、递送效率、分子毒性机制或构效关系。EODs在聚合物域内的保留量、释放动力学、释放油组分、胚胎摄取、生物利用度及机制性生物标志物均未测量。连续水性暴露不能模拟皮肤给药途径，因此斑马鱼结果应视为早期全生物体危害识别数据，而非皮肤毒性或临床风险的直接证据。斑马鱼实验中观察到的浓度依赖性不良反应提示，在局部抗寄生虫（特别是针对皮肤利什曼病的未来局部用药策略）开发路径中，剂量优化和应用特异性安全评价是后续研究的必要条件。
**研究结论**
本研究证明，Pluronic F127/Carbopol 974P纳米凝胶提供了一种均匀、水可分散的D. stelechantha疏水性精油制剂，适用于不添加有机助溶剂或其他外部分散载体的水性生物暴露。nGDs的预期开发方向是早期局部抗寄生虫制剂平台，尤其针对未来与皮肤利什曼病相关的局部用药策略。在本全生物体脊椎动物危害评估中，nGDs诱导了影响存活、孵化、神经行为、心脏功能和形态学的浓度依赖性不良反应，而无油聚合物对照制剂（P）未重现相同的发育毒性特征。这些发现表明，在确定局部用药或治疗适应性之前，需要进行大量剂量优化和应用特异性安全性评估。由于持续性水性胚胎暴露不能模拟皮肤给药，本研究报告的发育响应应解读为早期全生物体危害识别数据，而非皮肤毒性或临床风险的直接证据。
理化分析包括FTIR、DSC、DLS、SEM和AFM，确定了P与nGDs在光谱行为、热转变、温度依赖性流体动力学参数、干燥样品形态、粘附力和表观纳米力学性能方面的差异。这些发现证明了制剂依赖性的理化差异，但未直接解析EODs组分的分子定位，也未确定特定的自组装机制。此外，由于未进行释放、生物可利用组分、摄取、组织分布和机制学测量，不能在这些材料层面的差异与斑马鱼中观察到的发育响应之间推断因果关系。
本研究的创新之处不在于Pluronic F127/Carbopol 974P基质本身，其已是公认的制剂平台。科学进展在于，以相应的无油基质为对照，通过整合致死、发育、神经行为、心脏和形态学终点，在脊椎动物模型中确定了含EODs完整系统的制剂特异性发育危害特征。总体而言，研究结果凸显了在含有疏水性精油的水可分散制剂开发过程中，将材料表征与生物安全性筛选相结合的重要性。本研究结果表征了nGDs作为完整制剂的发育安全性特征，并证明聚合物载体本身并不能解释观察到的不良反应。由于研究并非为游离与制剂化EODs的比较而设计，因此未就制剂是否增强、减轻或以其他方式改变精油的内在毒性得出任何结论。
本文报道的初步宏观观察结果并不能确定长期理化、胶体或化学稳定性。因此，进一步的制药开发应包括定量稳定性指示研究，使用多个独立制备的制剂批次和预定的储存间隔，纵向监测流体力学直径、PDI、zeta电位、pH和EODs含量。还应通过GC–MS指纹图谱和经过验证的定量分析，在基线和预定储存间隔评估组分分辨的化学稳定性，包括监测代表性标记成分和潜在降解或氧化产物。需要保留完整的仪器输出，包括强度分布曲线和 correlograms，以评估分布宽度、潜在多峰性和聚集情况，并支持批次水平的统计比较。还需要在应用相关温度下进行稳态剪切和振荡流变分析，以表征粘度、流动行为、粘弹性、屈服行为和温度依赖性凝胶化。
此外，需要经过验证的组分分离和色谱方法来测定EODs总回收率、聚合物结合油组分、包封效率和分析载药量。还应研究释放动力学、生物可利用油组分、生物摄取和机制性生物标志物，以阐明制剂性质与生物响应之间的关系。对于预期的局部抗寄生虫开发路径，后续研究应在考虑局部治疗适应性之前，评估细胞内无鞭毛体活性、感染巨噬细胞、哺乳动物细胞选择性、皮肤释放、皮肤滞留和渗透、局部耐受性以及体内功效。
