《ACS Nano》：Nanobodies Equipped with HaloTag Enable Scalable Fluorescence-Lifetime Multiplexing
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荧光寿命（FL）是多重成像的一种稳健策略；然而，当用于亲和探针时，荧光团局部微环境的变异性会拓宽寿命分布，限制了其实用性。研究人员创建了一个模块化平台，利用纳米抗体–HaloTag变体进行FL编码，实现通用FL多重成像。通过表征四种HaloTag变体上的数十种
荧光寿命（FL）是多重成像的一种稳健策略；然而，当用于亲和探针时，荧光团局部微环境的变异性会拓宽寿命分布，限制了其实用性。研究人员创建了一个模块化平台，利用纳米抗体–HaloTag变体进行FL编码，实现通用FL多重成像。通过表征四种HaloTag变体上的数十种荧光团，研究人员生成了一个FL图谱，揭示了单光谱内可调谐、一致的FL特征。利用这种物理化学定义的编码，研究人员在单次染色步骤中实现了多达八个靶标的多重成像，同时在细胞和组织样本中保持了较高的空间保真度。与传统抗体标记不同，该方法将探针身份与物种限制解耦，并消除了FL中批次间变异性。这些结果证实了纳米抗体引导的FL工程化作为一种可扩展的多重成像策略（NanoFLex），为FL多重成像提供了标准且简便的框架，并拓展了光学读出的可及维度。
**NanoFLex：基于纳米抗体–HaloTag的荧光寿命多重成像平台**
荧光寿命（Fluorescence Lifetime, FL）是荧光团在激发后处于激发态的平均时间，是一个对局部微环境（如极性、pH值、邻近氨基酸残基相互作用）敏感的内在参数。荧光寿命成像显微镜（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）利用这一参数提供额外的成像对比度，超越了传统的光谱分离维度。然而，荧光团在亲和探针上的局部微环境变异性常常导致寿命分布展宽，限制了FL多重成像的实际应用。HaloTag（HT）系统提供了一个明确的结合口袋，能够屏蔽荧光团免受溶剂影响并稳定其光物理行为，因此特别适用于FL编码。Frei等人此前通过工程化HaloTag变体（HT7、HT9、HT10和HT11）调节结合荧光团的局部化学环境，在活细胞中使用单一荧光团实现了多达三种目标蛋白的多重成像，并仅在寿命域中解码。然而，现有FL多重方法大多依赖细胞器特异性染料或预定义的化学靶向策略，缺乏对任意目标蛋白的灵活性；随机标记策略（如随机偶联抗体）则引入荧光团环境异质性，导致寿命分布不均且重现性差。这些问题共同限制了FL多重成像的广泛应用。
针对上述挑战，研究人员提出了一种将荧光寿命编码与光谱分离和细胞器特异性解耦的策略。通过将工程化HT变体与纳米抗体（Nanobody, Nb）融合，将寿命编码扩展到任何可被纳米抗体或抗体识别的目标蛋白，而无需对靶蛋白进行基因操作。在此构型中，HT变体定义荧光团的局部环境进而决定其寿命特征，纳米抗体提供靶向特异性。模块化设计使得相同或光谱重叠的荧光团可以在FL域中被可靠分离。为进一步增强通用性，研究人员将这一策略与免疫荧光结合，使用二抗纳米抗体（2.Nbs）识别常规一抗（1.Abs），形成OneStep-IF工作流程，消除了连续染色需求并解除物种限制。该平台被命名为NanoFLex（Nanobody-guided Fluorescence Lifetime multiplEXing），即纳米抗体引导的荧光寿命多重成像。
研究人员通过系统表征26种HaloTag配体（HaloTag Ligands, HTLs）偶联的荧光团在四种工程化HT变体（HT7、HT9、HT10、HT11）上的荧光寿命行为，建立了一个定量的光谱-寿命参考图谱，定义了可访问的编码空间，支持合理选择具有良好分离度且可重现寿命特征的荧光团-HT组合。基于该物理化学定义的编码，NanoFLex利用常规共聚焦FLIM仪器和常规激发波长，在单次染色步骤中实现了多达八个靶标的多重成像。该方法兼容固定细胞、组织切片和荧光蛋白，并可与混合标记策略结合以进一步扩展多重容量。
**关键技术与方法**
该研究主要涉及以下几项关键技术方法：（1）荧光寿命成像显微镜（FLIM）结合时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting, TCSPC）进行寿命数据采集，使用Leica STELLARIS 8共聚焦FLIM系统和自定义共聚焦FLIM装置；（2）相量图分析（Phasor Analysis）用于寿命群体的可视化分离和目标分配；（3）荧光标记HaloTag配体（HTL）的化学合成，包括NHS-酯衍生物偶联和羧酸染料的TSTU活化偶联策略；（4）OneStep-IF单步免疫荧光标记工作流程，将一抗与HT融合的二抗纳米抗体预组装为染色复合物；（5）样本来源包括COS-7细胞系以及来自德国哥廷根大学医学中心动物设施饲养的Lewis大鼠（LEW/Crl背景）脑冷冻切片。
**结果与讨论**
**NanoFLex的概念设计与实验验证**
为将概念框架转化为实际可扩展的成像策略，研究人员将Nb–HT融合体作为模块化FL编码探针，并在免疫荧光工作流程中评估其性能。实验表明，不同HT变体能够将可分离的荧光寿命施加于光谱重叠的荧光团上，且这种编码可在免疫标记格式中利用。采用二抗纳米抗体（2.Nb）方法识别常规一抗，实现OneStep-IF工作流。使用针对Clathrin和GALNT2（高尔基体驻留蛋白）的两种兔源一抗，分别与2.NbHT7或2.NbHT11及光谱重叠的荧光团偶联，标记COS-7细胞后，本无法通过颜色区分的信号在FL域中被稳健分离，分别对应散布的网格蛋白小窝和核周高尔基体结构。随后，研究人员系统表征了26种HTL-荧光团在四种HT变体上的FL（图1e），生成光谱-寿命图谱，为NanoFLex多重实验的合理设计提供了依据。
**细胞背景下的NanoFLex多重成像**
利用寿命图谱中确定的组合，研究人员在标准共聚焦FLIM条件下评估了多重成像能力。通过将不同HT变体分配给各标记探针，在同一光谱通道内实现多个靶标的同步检测。表达LaminA-Y71L-mCherry（即不发光的mCherry突变体）的COS-7细胞中，使用抗mCherry的1.Nb-HT7标记核纤层蛋白，同时用1.Ab预复合HT融合2.Nb标记α-微管蛋白。即使使用相同荧光团（AF488、JF549、BD655），相应信号在相量空间中形成清晰可分离的群体，每个光谱通道的信息容量有效翻倍，将常规三色实验转换为六靶标读出。此外，NanoFLex与遗传编码荧光蛋白（Fluorescent Proteins, FPs）的兼容性得到验证：转染TOMM70跨膜域融合mEGFP、mCherry或miRFP670的COS-7细胞，其线粒体胞质面信号与过氧化物酶体的HT标记信号尽管光谱重叠，仍可通过寿命分布可靠分离。荧光蛋白的特征寿命（mEGFP 2.07±0.05 ns；mCherry 1.35±0.09 ns；miRFP670 1.61±0.02 ns）使其易于整合到编码方案中。平均FL串扰为2.8±1.7%，空间重叠为7.6±4.9%。与Tau-STED超分辨成像的初步兼容性实验也表明，在选定荧光团-HT组合和采集参数下可实现双靶标寿命分离。
**可靠基于寿命的多重成像的设计约束**
尽管FL编码可在单一光谱通道内分离多个发射体，但实际性能受限于光子统计和标记结构的空间重叠。在密集标记的生物样本中，不同靶标的信号常在同一衍射极限像素内重叠，产生混合衰减曲线并降低可分离性。为确保稳健可靠的靶标区分，研究人员采取了保守策略：每个光谱通道仅分配两个分离良好的荧光寿命群体，要求寿命差≥0.5 ns。在此标准下，培养细胞中寿命串扰仅为2.3%，组织中为4.5%，同时保持相量分析简单和高置信度靶标分配。该阈值应视为实用设计指南而非物理极限。这一约束不限制整体多重能力，而是定义了寿命维度与光谱维度的有效结合方式——通过将靶标分布到多个激发波长并在每通道分配两个寿命分辨物种，NanoFLex保持可扩展性的同时实现稳健分离。
**细胞和组织中基于寿命编码的高多重成像**
按照设计规则结合光谱和寿命编码，研究人员在单步染色中实现了高多重成像。在培养的COS-7细胞中，同时标记了8个亚细胞靶标：TOMM20（线粒体）、PMP70（过氧化物酶体）、NUP50（核孔复合物）、GALNT2（高尔基体）、Tubulin（微管）、Lamin（核纤层）、Clathrin和Vimentin（中间丝），使用1.Abs、HT融合2.Nbs以及具有良好分离寿命特征的荧光团-HT组合。靶标分布在多个激发波长上，每个光谱通道分配两个寿命分辨物种（405 nm和700 nm激光激发的Clathrin和Vimentin信号通过颜色分离）。尽管荧光团间存在大量光谱重叠，所有靶标在FL域中被稳健分离，图像保持亚细胞细节和结构连续性。预组装1.Ab–Nb–HT复合物的OneStep-IF工作流程避免了对同一物种一抗的兼容性限制。在更复杂的生理相关样本中，研究人员将该策略应用于大鼠脑冷冻切片，结合HT探针和直接染料偶联的二抗纳米抗体，实现六种蛋白靶标加DAPI核染色的同步检测。直接标记探针的整合在HTL不可用时提供了额外灵活性。组织环境中寿命对比的固有优势在于：内源性自发荧光通常具有较短寿命和多衰减组分，可轻易与NanoFLex标记信号分离。此外，NanoFLex不需要样本基因表达HaloTag，而是通过纳米抗体探针引入，为无法进行基因操作的人源组织和活检样本开辟了多重成像机会。
**讨论与结论**
讨论部分指出，NanoFLex框架将FL从环境依赖的变量转变为可编程且可转移的编码参数。通过系统表征确立的FL图谱和实验导出的设计规则（每通道两个寿命群体，≥0.5 ns分离），该方法确保了稳健分离和可靠的空间（亚细胞）分配。与传统依赖通用染料或连续标记的方法相比，NanoFLex能够利用标准抗体实现快速、靶标特异、单步的多重成像，同时保持跨靶标的灵活性。光谱与寿命维度的结合使多重容量可随常规共聚焦FLIM仪器扩展，并在细胞和组织中保持亚细胞分辨率。该策略特别适用于人类来源的组织和活检等复杂样本，因为HaloTag功能通过纳米抗体探针引入，避免了基因操作需求，同时寿命对比能够分离短寿命自发荧光。
研究结论可总结为：研究人员通过将工程化HT变体与纳米抗体引导的免疫标记结合，建立了一个基于FL的多重成像模块化框架。荧光团-HT对的系统表征定义了全面的FL图谱，实现合理的探针选择并将FL转化为可编程的编码参数。通过将探针身份与随机抗体标记和物种限制解耦，HT融合纳米抗体能够使用标准抗体实现一致、靶标特异、单步的多重成像。光谱与寿命维度的结合在常规共聚焦FLIM仪器上实现了多重容量的可扩展扩展，且保持了亚细胞分辨率。随着具有更宽荧光寿命多样性的新型HT兼容荧光团的出现，以及改进的计算寿命分解方法的应用，NanoFLex的多重能力预计将远超当前实现，推动细胞、组织和临床样本的高内涵成像。该研究发表在《ACS Nano》上，为荧光寿命多重成像提供了标准化、简便且通用的框架，拓展了光学读出的可及维度，对生物学研究和临床诊断具有重要的方法论意义。
