安罗替尼通过抑制 c-MET/AKT/mTOR 信号通路并改变自噬相关蛋白表达，抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

《Anti-Cancer Drugs》：Anlotinib inhibits glioma cell proliferation, migration, and invasion by suppressing c-MET/AKT/mTOR signaling and altering autophagy-associated protein expression

　　

胶质瘤仍难以治疗，因为恶性细胞表现出快速增殖、弥漫性侵袭和频繁复发。本研究调查了阿帕替尼在人体胶质瘤细胞中的直接抗肿瘤效应，并检验这些效应是否与肝细胞生长因子受体/蛋白激酶B/雷帕霉素 mechanistic target（c-MET/AKT/mTOR）信号通路、凋亡相关反应、间质转化相关蛋白及自噬相关蛋白有关。U87和U251细胞在体外接受阿帕替尼处理。细胞活性通过CCK-8试剂盒测定，迁移和侵袭通过划痕实验和Transwell实验评估，Hoechst 33342染色用于凋亡相关核形态的定性评估，蛋白表达通过Western blot分析。阿帕替尼以浓度依赖的方式降低细胞活性，U87细胞和U251细胞的估计24小时IC50值分别为68.00 μM和45.53 μM。在较低浓度下，阿帕替尼减少伤口闭合和Transwell侵袭，降低Vimentin、N-cadherin和β-catenin的表达，增加BCL-2相关X蛋白（BAX）表达，降低BCL-2表达，改变PARP/caspase-9表达，减少c-MET总表达，降低AKT/mTOR磷酸化。自噬相关蛋白分析显示LC3-II/LC3-I比值增加及p62随时间变化。阿帕替尼可能在体外抑制恶性胶质瘤细胞表型。这些表型变化与c-MET/AKT/mTOR通路蛋白、凋亡相关反应、间质转化相关蛋白及自噬相关蛋白表达的改变有关。

引言

弥漫性胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，现根据组织学和分子整合标准在2021年WHO框架下进行分类[1]。胶质母细胞瘤是最具侵袭性的成人型弥漫性胶质瘤，其特征为快速增殖、弥漫性浸润、治疗抵抗和频繁复发[2,3]。尽管最大安全切除后配合放射治疗和替莫唑胺仍然是胶质母细胞瘤的标准治疗核心[4,5]，但预后仍不理想，尤其是复发或难治性疾病[6]。因此，能够抑制胶质瘤生长和侵袭行为的其他治疗药物仍具有重要的临床意义。

阿帕替尼是一种口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，对参与肿瘤血管生成和增长的多种受体酪氨酸激酶具有活性，包括血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子受体和c-Kit[7]。临床研究表明，阿帕替尼单独使用或与贝伐珠单抗联合使用可能对复发性高级别胶质瘤有效[8]。然而，由于阿帕替尼通常作为抗血管生成多激酶抑制剂来讨论，其对胶质瘤细胞存活、运动性和细胞内信号通路的直接影响需要进一步阐明。

肝细胞生长因子受体（c-MET），即肝细胞生长因子的受体，越来越多地被确认为恶性胶质瘤中的信号枢纽。c-MET的异常激活与胶质瘤细胞增殖、侵袭、治疗抵抗及干样肿瘤细胞群体的维持有关[9–12]。这些效应至少部分通过下游磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（AKT）/雷帕霉素 mechanistic target（mTOR）信号通路介导。AKT促进细胞存活、代谢适应和运动性，而mTOR整合生长因子和营养信号以调节蛋白质合成、细胞周期进程、应激反应和自噬[13–15]。在胶质瘤中，自噬作为情境依赖的应激适应通路，可以支持肿瘤细胞存活、重塑肿瘤微环境，并参与对放疗或替莫唑胺的耐药[16,17]。胶质瘤侵袭还伴随间质转化样变化，而非经典的上皮-间质转化（EMT），表现为Vimentin、N-cadherin和β-catenin等标志物表达的改变[18,19]。这些相互关联的通路为研究阿帕替尼是否通过c-MET/AKT/mTOR信号通路、自噬相关蛋白和凋亡相关反应影响胶质瘤增殖、迁移和侵袭提供了理论依据。

在本研究中，我们检验了阿帕替尼是否抑制U87和U251细胞的活性、迁移和侵袭。我们进一步评估了这些效应是否伴随凋亡相关反应、间质转化相关蛋白、自噬相关蛋白及c-MET/AKT/mTOR通路蛋白的变化。

材料与方法

化合物

阿帕替尼购自 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd.（南京，中国）。该化合物溶于二甲基亚砜（Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA），并在使用前以培养基稀释至指定浓度。

细胞和培养

人体U87和U251胶质瘤细胞购自中国科学院细胞库（上海，中国）。细胞系真实性通过短串联重复谱分析进行验证，并常规通过标准测试排除支原体污染。细胞在Dulbecco's改良鹰基培养基（DMEM; Mediatech, Herndon, Virginia, USA）中培养，补充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，置于37°C含5% CO?的湿润气氛中培养。定期在光学显微镜下观察细胞，进行胰蛋白酶消化和传代，使用对数生长期细胞进行后续实验。

细胞活性测定

使用CCK-8试剂盒（Beyotime Biotechnology, Shanghai, China）测量细胞活性。将细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，贴附24小时。随后用0、10、20、40或80 μM阿帕替尼处理24小时。向每孔加入CCK-8试剂，孵育1小时，测定450 nm处的吸光度。使用SigmaPlot软件（Systat Software, San Jose, California, USA）计算IC50值。

划痕实验

将细胞接种于六孔板中，培养至形成致密单层。使用无菌p200枪头制造线性划痕。用PBS冲洗去除脱落细胞，然后用含0、5、10或20 μM阿帕替尼的培养基孵育24小时。在0和24小时使用相差显微镜拍摄图像。使用ImageJ软件量化伤口闭合距离。每个样品分析四个配对视野。

Transwell侵袭实验

使用Matrigel包被的24孔Transwell小室评估细胞侵袭。将U87和U251细胞（1×10?个/孔）悬浮于200 μl无血清DMEM中，加入上室。下室加入含10%胎牛血清的DMEM（600 μl）作为趋化剂。在24小时实验中用0、5、10或20 μM阿帕替尼处理细胞。轻轻去除残留于上膜表面的细胞。下表面侵袭的细胞用冷甲醇固定45分钟，并用1%结晶紫染色。在显微镜×200放大倍率下随机选取五个视野拍摄并计数侵袭细胞。

Hoechst 33342染色

将两条胶质瘤细胞系分别以4×10?个/孔的密度接种于12孔板中，培养24小时。然后用10 μM阿帕替尼处理细胞。孵育24小时后，用PBS洗涤两次，用3.7%甲醛固定，并用Hoechst 33342（Beyotime Biotechnology）染色10分钟。在倒置荧光显微镜下，核凝聚或碎片化的细胞被认为显示凋亡相关核形态。Hoechst染色作为定性形态学评估使用。

Western blot分析

对于浓度-反应实验，U87和U251细胞用0、5、10或20 μM阿帕替尼处理24小时。对于自噬时间进程实验，细胞用10 μM阿帕替尼处理0至96小时的指定时间。细胞用补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀实验缓冲液（Beyotime Biotechnology）裂解。使用双缩脲酸法测定蛋白浓度。等量蛋白经10% SDS-PAGE分离并转至聚偏二氟乙烯膜。膜在室温下用BSA封闭1小时，然后在4°C下与抗c-MET、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT、Vimentin、N-cadherin、β-catenin、ATG5、p62/SQSTM1、LC3、poly(ADP-ribose) polymerase（PARP）、caspase-9、BCL-2、BAX和GAPDH的抗体孵育过夜。所有抗体购自Cell Signaling Technology（Danvers, Massachusetts, USA）。用含Tween-20的Tris缓冲液清洗后，膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1.5小时。使用增强化学发光试剂显影蛋白条带，并用ImageJ软件定量。Western blot进行了三次独立生物学实验。目标蛋白以GAPDH归一化，磷酸化AKT和mTOR分别以总AKT和总mTOR额外归一化。从显示一致表达模式的独立实验中选取代表性条带。

统计分析

使用GraphPad Prism 8.02（GraphPad Software, San Diego, California, USA）进行统计分析。数据表示为三次独立生物学实验的均值±标准差。两组间比较使用Student's t检验或单因素方差分析加Tukey事后分析。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。

结果

阿帕替尼抑制胶质瘤细胞活性

为确定阿帕替尼是否影响胶质瘤细胞生长，将U87和U251细胞暴露于阿帕替尼中24小时。相差显微镜显示处理后出现形态变化，包括细胞密度降低、细胞缩小、圆缩和脱落（图1a）。CCK-8测定进一步表明阿帕替尼以浓度依赖的方式降低两种胶质瘤细胞系的细胞活性。处理24小时后，U87细胞的估计IC50值为68.00 μM，U251细胞为45.53 μM（图1b）。这些发现表明阿帕替尼在体外抑制胶质瘤细胞活性。

图1 阿帕替尼抑制胶质瘤细胞活性。U87和U251细胞用递增浓度的阿帕替尼处理24小时。(a) 通过相差显微镜观察到的形态变化。所有显微照片均在同一放大倍率下获取（标尺=200 μm）。(b) 通过CCK-8实验评估细胞活性。所有数据均代表三次独立实验，并以均值±标准差表示。星号表示与相应未处理对照（0 μM）的比较；P值小于0.05被认为具有统计学显著性（*P<0.05, **P<0.01）。CCK-8，CCK-8试剂盒。

阿帕替尼抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭

由于高药物浓度可能通过细胞毒性干扰运动性实验，后续的迁移和侵袭实验使用较低浓度的阿帕替尼（5、10和20 μM）。与对照细胞相比，阿帕替尼显著减少U87和U251细胞24小时后的伤口闭合（图2a）。在Transwell侵袭实验中，阿帕替尼处理后侵袭的U87和U251细胞数量减少（图2b）。这些结果表明阿帕替尼在低于24小时IC50值的浓度下抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭。

图2 阿帕替尼抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭。U87和U251细胞用0、5、10或20 μM阿帕替尼处理24小时。(a) 划痕实验显示伤口闭合减少。所有显微照片均在同一放大倍率下获取（标尺=200 μm）。(b) Matrigel包被的Transwell实验显示阿帕替尼处理后侵袭减少；代表性Transwell图像在×200放大倍率下获取。所有数据均代表三次独立实验，并以均值±标准差表示。P值小于0.05被认为具有统计学显著性（*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001）。

阿帕替尼随时间改变自噬相关蛋白表达

进行Western blot分析以检查阿帕替尼对自噬相关蛋白的影响。用5、10和20 μM阿帕替尼处理24小时后，p62表达和LC3-II/LC3-I比值增加，而ATG5表达未显示明显的浓度依赖增加（图3a）。在10 μM阿帕替尼的时间进程分析中，p62表达在12小时下降，随后在较晚时间点逐渐恢复，而LC3-II/LC3-I比值总体上随时间增加，在96小时略有减少（图3b）。在96小时，p62和ATG5表达明显下降，这可能反映了长期药物暴露后可存活细胞蛋白丰度降低。总之，这些数据表明阿帕替尼以浓度和时间依赖的方式改变了自噬相关蛋白表达。

图3 阿帕替尼改变了自噬相关蛋白表达。(a) 用0、5、10或20 μM阿帕替尼处理24小时后p62、LC3和ATG5的Western blot分析。星号表示与相应未处理对照（0 μM）的比较。(b) 用10 μM阿帕替尼处理0至96小时的时间进程分析。所有数据均代表三次独立实验，并以均值±标准差表示。星号表示与0小时组的比较。P值小于0.05被认为具有统计学显著性（*P<0.05）。

阿帕替尼减少间质转化相关蛋白

为探索迁移和侵袭减少是否与间质转化相关蛋白有关，使用Western blot检测5、10和20 μM阿帕替尼处理后Vimentin、N-cadherin和β-catenin的表达。阿帕替尼降低了胶质瘤细胞中这些蛋白的表达（图4）。这些发现表明阿帕替尼降低了EMT相关蛋白的表达，与其对胶质瘤细胞运动性的抑制作用并行。

图4 阿帕替尼减少了间质转化相关蛋白。Western blot分析显示用5、10或20 μM阿帕替尼处理后Vimentin、N-cadherin和β-catenin表达减少。所有数据均代表三次独立实验，并以均值±标准差表示。

星号表示与相应的未处理对照组 (0 μM) 的比较。P 值小于 0.05 被认为具有统计学意义 (*P < 0.05)。
安罗替尼促进凋亡相关的核和分子变化
使用 Hoechst 33342 染色定性评估安罗替尼处理后的核形态变化。对照组细胞显示相对均匀和弥散的核染色，而安罗替尼处理的细胞表现出更亮的浓缩染色、核碎裂和细胞密度降低 (图 5a)。蛋白质印迹分析进一步显示与凋亡相关的变化，包括 BAX 增加和 BCL-2 表达减少，以及 PARP 和 caspase-9 蛋白表达的改变 (图 5b)。这些发现表明安罗替尼促进胶质瘤细胞凋亡相关的核和分子变化。
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图 5
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安罗替尼促进胶质瘤细胞凋亡相关的核和分子变化。(a) 代表性的 Hoechst 33342 图像定性显示用 10 μM 安罗替尼处理 24 h 后核浓缩和碎裂；所有显微照片均在相同放大倍数下获取 (比例尺 = 50 μm)。(b) 蛋白质印迹显示 BAX 增加和 BCL-2 表达减少，以及 PARP 和 caspase-9 表达的改变。所有数据代表三次独立实验，并表示为均值 ± 标准差。星号表示与相应的未处理对照组 (0 μM) 的比较。P 值小于 0.05 被认为具有统计学意义 (*P < 0.05)。AKT, 蛋白激酶 B; BAX, BCL-2 关联 X 蛋白; BCL-2, B 细胞淋巴瘤 2; c-MET, 肝细胞生长因子受体; mTOR, 雷帕霉素靶蛋白; PARP, 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶。
安罗替尼抑制 c-MET/AKT/mTOR 信号传导
为了探索与安罗替尼抗肿瘤作用相关的信号通路，在用 5、10 和 20 μM 安罗替尼处理后，通过蛋白质印迹检查 c-MET/AKT/mTOR 相关蛋白。安罗替尼处理减少了总 c-MET 表达并降低了 AKT 和 mTOR 的磷酸化 (图 6)。研究结果表明，安罗替尼暴露与胶质瘤细胞中总 c-MET 丰度减少和 AKT/mTOR 磷酸化降低相关。
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图 6
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安罗替尼抑制总 c-MET 表达和 AKT/mTOR 磷酸化。蛋白质印迹显示用 5、10 或 20 μM 安罗替尼处理后，总 c-MET 表达减少以及 AKT 和 mTOR 磷酸化降低。所有数据代表三次独立实验，并表示为均值 ± 标准差。星号表示与相应的未处理对照组 (0 μM) 的比较。P 值小于 0.05 被认为具有统计学意义 (*P < 0.05)。AKT, 蛋白激酶 B; BAX, BCL-2 关联 X 蛋白; BCL-2, B 细胞淋巴瘤 2; c-MET, 肝细胞生长因子受体; mTOR, 雷帕霉素靶蛋白; PARP, 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶。
讨论
本研究显示安罗替尼影响胶质瘤细胞的几种相互关联的恶性行为。在 U87 和 U251 细胞中，安罗替尼降低了短期活力，损害了迁移和侵袭，减少了间质转化相关蛋白，促进了凋亡相关的核和蛋白变化，减少了总 c-MET 表达和 AKT/mTOR 磷酸化，并改变了与自噬相关的蛋白表达。
活力的降低与新兴证据一致，即安罗替尼可以直接作用于胶质瘤细胞，超出其已确立的抗血管生成谱。最近的一项代谢组学和脂质组学研究显示，安罗替尼抑制 C6 胶质瘤细胞增殖并影响氨基酸代谢、能量代谢、神经酰胺代谢和甘油磷脂代谢 [20]。这些数据与本研究结果相关，因为 AKT/mTOR 活性与营养感应、蛋白质合成和代谢适应密切相关 [14,21]。因此，在 U87 和 U251 细胞中观察到的活力降低可能反映了生存信号和代谢稳态的更广泛扰动，而不是孤立的生长抑制。
观察到的总 c-MET 表达减少和 AKT/mTOR 磷酸化降低与活力和运动性结果一致。MET 激活已与胶质瘤侵袭、耐药和干细胞样肿瘤细胞状态相关 [9,10,12]。AKT/mTOR 信号传导也促进胶质母细胞瘤细胞增殖、迁移、侵袭性和干性，正如在 mTORC2/AKT 抑制对抗这些恶性特性的研究中所显示的那样 [22]。此外，据报道 DRR1 通过 AKT 激活促进胶质母细胞瘤细胞侵袭和上皮 - 间质转化 [13]。由于未检查磷酸化的 c-MET，现有数据并未确立安罗替尼抑制 c-MET 激活。因此，结果支持安罗替尼暴露、总 c-MET 丰度减少和 AKT/mTOR 磷酸化降低之间的关联，而不是直接通路因果关系。
迁移和侵袭结果伴随着 Vimentin、N-cadherin 和 β-catenin 表达减少。在胶质母细胞瘤中，间质转化样状态与细胞运动性、基质相互作用、治疗耐药和更差的生物学行为相关 [19,23]。β-Catenin 尤为相关，因为它连接粘附、Wnt 信号传导和支持迁移的转录程序。胶质母细胞瘤的研究表明，减少 β-catenin 信号传导可以抑制迁移、侵袭、EMT 标志物表达和血管生成特征 [24]。因此，β-catenin 与 Vimentin 和 N-cadherin 的下降为本研究中观察到的伤口闭合减少和 Transwell 侵袭减少提供了安罗替尼治疗与减少之间的机制桥梁。
与凋亡相关的结果进一步解释了安罗替尼暴露后存活胶质瘤细胞的丢失。Hoechst 染色显示核浓缩和碎裂，而蛋白质印迹显示 BAX 增加和 BCL-2 减少，以及 PARP 和 caspase-9 的变化。BAX/BCL-2 平衡是线粒体凋亡易感性的核心决定因素，BCL-2 家族靶向已被探索作为胶质母细胞瘤中基于凋亡的策略 [25,26]。在这种情况下，现有数据表明安罗替尼暴露伴随着与凋亡相关的变化，以及总 c-MET 丰度减少和 AKT/mTOR 磷酸化降低。
与自噬相关的发现增加了细胞对安罗替尼反应的另一个层次，但应将其解释为蛋白表达的变化，而不是自噬活性改变的确凿证据。在时间过程实验中，p62 在 12 h 减少，然后在后期时间点恢复，而 LC3-II/LC3-I 显示随时间总体增加。因为 p62/SQSTM1 是一种结合 LC3 并通过自噬途径降解的选择性自噬受体，其早期减少可能反映自噬激活的早期阶段或增强的自噬降解 [27,28]。p62 的后期恢复，连同持续的 LC3 转化，表明反应可能不是线性的，可能涉及补偿性应激信号、改变的溶酶体降解或自噬相关蛋白周转的变化。这种解释与自噬标志物调节的动态性质一致 [29]，但需要直接的通量测定来确定自噬活性是增强、阻断还是动态调节。在胶质母细胞瘤中，p62 和其他自噬相关因素也与干细胞迁移和侵袭相关 [30]，而自噬相关信号传导可以与 Wnt/β-catenin 活性相互作用 [31,32]。这些研究将现有的 LC3、p62 和 ATG5 变化置于生物学有意义的背景下：安罗替尼可能通过对 mTOR 依赖性自噬调节和间质转化相关信号传导的协调影响来影响胶质瘤行为。
综上所述，结果将安罗替尼定位为一种多靶点药物，它可能同时干扰几个与胶质瘤相关的过程。除了其抗血管生成活性外，最近的研究开始检查安罗替尼暴露对胶质瘤的细胞和分子后果，包括胶质瘤细胞中的代谢组学和脂质组学改变 [20]。最近的一项系统评价和荟萃分析也强调了将安罗替尼加入高级别胶质瘤放化疗中日益增长的兴趣 [33]。本体外研究通过链接安罗替尼暴露与增殖和侵袭减少、凋亡相关变化、总 c-MET 表达减少和 AKT/mTOR 磷酸化降低，以及与自噬相关的蛋白表达改变，为该领域增加了细胞和分子证据。在患者来源的胶质瘤模型和颅内肿瘤系统中的进一步验证，连同通路挽救和自噬通量测定，将有助于定义这些发现的因果和转化相关性。
在解释这些发现的转化相关性时应考虑药物暴露。虽然临床药代动力学数据支持安罗替尼按 2 周开/1 周停的日程每天口服 12 mg 的重复给药 [34]，但此处使用的微米浓度是为了在体外定义直接的细胞反应。这些浓度可能不直接反映临床可达到的游离血浆或颅内肿瘤暴露。因此，在将这些发现外推到临床活性之前，需要进行药代动力学和药效学验证。
应承认几个局限性。首先，所有实验均在体外进行，无法重现胶质瘤微环境或血脑屏障的影响。其次，该研究仅使用了两种建立的胶质瘤细胞系。缺乏患者来源的胶质瘤细胞或胶质瘤干细胞样模型进一步限制了结果的生物学异质性和临床代表性。此外，缺乏体内颅内肿瘤验证阻碍了对药物递送、脑组织中的侵袭行为和全身耐受性的评估。在机制上，信号数据仍是关联性的，因为未进行通路挽救实验，如 c-MET 恢复或 AKT/mTOR 再激活。最后，体外使用的安罗替尼浓度需要谨慎解释，因为本研究未确定这些暴露是否在血浆或颅内肿瘤中临床可达。未来的研究应整合患者来源模型、颅内胶质瘤系统、通路挽救方法和药代动力学分析，以阐明这些发现的转化相关性。
结论
总之，安罗替尼在体外抑制胶质瘤细胞活力、迁移和侵袭。这些效应与总 c-MET 表达减少和 AKT/mTOR 磷酸化降低、凋亡相关变化、间质转化相关蛋白下调以及与自噬相关的蛋白表达随时间变化相关 (图 7)。研究结果支持对胶质瘤中安罗替尼进行进一步的机制和体内研究，特别关注 c-MET 激活、通路挽救、自噬通量和临床可达到的药物暴露。
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图 7
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安罗替尼的拟议机制涉及抑制胶质瘤细胞中的恶性表型。安罗替尼治疗与总 c-MET 表达减少和 AKT/mTOR 磷酸化降低、增殖减少、迁移和侵袭抑制、间质转化相关蛋白减少、凋亡相关变化以及与自噬相关的蛋白表达改变相关。AKT, 蛋白激酶 B; BAX, BCL-2 关联 X 蛋白; BCL-2, B 细胞淋巴瘤 2; c-MET, 肝细胞生长因子受体; mTOR, 雷帕霉素靶蛋白; PARP, 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶。
致谢
本工作得到了浙江省医学科技计划项目 (No. 2025KY1491) 的支持。
X.L. 设计了项目想法，监督了整个研究，在关键时刻提供了关键的指导和方向，修改了手稿，并审查了手稿以确保符合科学严谨性。C.B. 设计和进行了实验，撰写了手稿，为研究准备了实验材料，并参与了数据解释。两位作者均同意手稿的最终版本。
在本手稿准备期间，作者仅为了校对和检测拼写和语法错误而使用 ChatGPT。作者声明，手稿的科学内容、数据分析或原创想法的任何部分都不是由人工智能生成的。作者已审查和编辑最终文本，并对论文的完整性和准确性承担全部责任。
利益冲突
没有利益冲突。