《Journal of Tissue Engineering》：Janus base nanotubes-driven biomimetic microenvironments for enhanced 3D cell spheroid development and extracellular matrix production
编辑推荐：
摘要：传统二维（2D）细胞培养依赖平坦的粘附基底，这不仅限制了细胞的三维生长空间，还缺乏细胞与细胞外基质（ECM）之间的复杂相互作用及多种信号通路，导致体外培养细胞的生存状态与其在体内的天然三维（3D）微环境存在显著差异，从而在体外研究复杂生物学问题时呈现固有
摘要：传统二维（2D）细胞培养依赖平坦的粘附基底，这不仅限制了细胞的三维生长空间，还缺乏细胞与细胞外基质（ECM）之间的复杂相互作用及多种信号通路，导致体外培养细胞的生存状态与其在体内的天然三维（3D）微环境存在显著差异，从而在体外研究复杂生物学问题时呈现固有局限性。本研究中，研究人员引入了受DNA启发的仿生纳米材料——Janus碱基纳米管（JBNTs），其设计旨在模拟天然组织中的长胶原纤维，以在传统2D培养体系内促进3D球体形成。在生理条件下，JBNTs中的赖氨酸基团赋予其正电荷，使得带负电的细胞和蛋白质能够通过静电相互作用吸附于材料表面，从而为细胞提供快速锚定位点，并促进细胞自发聚集形成3D结构。研究人员认为，这种工程化微环境可触发细胞自我调控，上调细胞膜受体蛋白及关键细胞外基质组分的表达。细胞与这些微环境元件相互作用，有助于形成稳定的3D细胞球体。此外，JBNTs诱导的球体细胞活力超过90%，且可使用胰蛋白酶轻松解离为单细胞进行传代培养，表现出优异的细胞相容性和高细胞可重复利用性，这有利于构建3D体外模型。本研究提出了一种构建3D微环境的创新方法，为引导细胞行为及推进3D细胞培养技术提供了新途径。
论文解读：JBNTs仿生纳米纤维支架构建3D细胞球体微环境的研究
一、研究背景与问题
自20世纪初以来，二维（2D）细胞培养一直是细胞研究的主要手段。然而，2D培养将细胞限制在平面基底上，不仅显著破坏细胞形态和空间组织，还削弱了细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）之间的关键相互作用。因此，传统2D体系无法再现体内三维（3D）微环境中天然组织的生理特性，在体外研究复杂生物学问题时存在固有局限。为克服这些限制，3D细胞培养技术应运而生，其通过模拟体内环境的关键特征（如细胞-细胞和细胞-ECM相互作用），建立适当的组织样结构和细胞分化状态。然而，现有3D培养技术存在显著缺陷：无支架方法（如悬滴法和超低附着板法）缺乏足够的锚定和结构支持，导致细胞被动无序聚集，球体内部常出现缺氧坏死核心；水凝胶支架虽提供结构支撑，但阻碍细胞迁移和直接细胞间相互作用，并使常规酶消化传代复杂化。因此，亟需开发一种既能提供结构支持，又能保持细胞间直接相互作用、更接近天然组织状态的的新型3D培养系统。
二、研究内容与结论
本研究提出了一种创新解决方案：受DNA启发的仿生柔性纳米材料——Janus碱基纳米管（JBNTs）。JBNTs的小分子单体基于胞嘧啶-鸟嘌呤（C-G）碱基对结构设计，可在水溶液中通过氢键、π-π堆积和疏水效应等非共价相互作用自组装形成直径3-5 nm的结构稳定纳米管。研究人员采用赖氨酸修饰策略功能化C-G单体，在保持纳米管疏水内壁的同时，通过氨基酸侧链引入亲水界面。在生理条件下，赖氨酸功能化的JBNTs表面带正电荷，可通过静电相互作用吸引带负电的蛋白质和细胞。与受体-配体结合机制不同，静电相互作用依赖长程、非特异性的多价电荷吸引，结合动力学显著加快。JBNTs利用这一快速静电机制有效吸引和粘附带负电细胞，建立初始粘附微环境，启动细胞自组织过程。
研究表明，JBNTs诱导的球体显著增强膜蛋白和ECM组分（包括纤连蛋白、层粘连蛋白和II型胶原）的表达与分泌。新分泌的ECM组分与JBNTs表面结合，激活整合素-ECM信号轴，协同增强细胞粘附和组织化。这些持续动态相互作用引导细胞自发自组装为结构稳定的3D球体，其中形成内源性组织的仿生微环境。与物理聚集形成的致密3D球体相比，基于JBNTs柔性支架构建的3D细胞球体内部结构更松散，这种结构可能有利于营养物质和氧气渗透至球体内部，从而提升三维培养中的细胞活力。实验证明，JBNTs诱导的球体可通过酶消化方案保留传代能力。
三、关键技术方法
研究人员主要采用了以下关键技术方法：材料表征方面，使用透射电子显微镜（TEM）观察JBNTs形貌，采用Malvern Zetasizer Pro系统测量粒径和ζ电位，利用紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱评估JBNTs在PBS、DMEM和完全培养基（CCM）中的稳定性。细胞实验方面，使用AT-3细胞（购自上海金源生物技术有限公司）和NIH-3T3细胞（由上海碧云天生物技术提供），在常规2D培养体系和超低附着（ULA）96孔U底板体系中加入JBNTs诱导球体形成。采用活/死细胞染色和CCK-8实验评估细胞活力与增殖。使用免疫荧光染色和Western blot检测ECM蛋白（纤连蛋白、层粘连蛋白、II型胶原）及整合素α5、E-钙粘蛋白表达。采用RNA测序（RNA-seq）分析差异表达基因，并通过RT-qPCR验证Sox9和PIM1等基因表达。利用聚-L-赖氨酸（PLL）作为电荷匹配阳离子聚合物对照，验证JBNTs球体诱导效应的特异性。使用0.25%和2.5%胰蛋白酶-EDTA评估球体消化传代能力。
四、研究结果
3.1 细胞在2D培养体系中与JBNTs自组装成球体
透射电镜显示JBNTs自聚集为细长纤维状结构。粒径分析显示50 μg/mL JBNTs平均粒径为222.5 nm，ζ电位为+17.8 mV。UV-Vis光谱证实JBNTs在PBS、DMEM和CCM中具有优异稳定性，220 nm和280 nm特征吸收峰在两周监测期内保持稳定。活细胞成像显示，细胞悬液加入含JBNTs培养基后数秒内迅速形成松散聚集的细胞球，随后2小时培养中逐渐致密化。定量分析显示，松散球体在混合后30秒横截面积为14,579 μm2，培养6小时后降至7,561.5 μm2（减少48.1%）。当JBNTs在CCM中ζ电位转为负值但仍观察到显著球体形成，表明局部正电荷区域可能仍驱动快速吸附。引入PLL作为电荷匹配对照，4 μg/mL PLL与30 μg/mL JBNTs ζ电位无显著差异，但PLL处理细胞仅形成局部细胞簇和不均匀单层样聚集物，未形成JBNTs诱导的3D球体样结构，证明正电荷单独不足以重现JBNTs的球体诱导效应。荧光标记显示JBNTs不仅分布在球体周围，还存在于球体内部并与细胞核共定位，正交图像显示球体厚度约50 μm，表明JBNTs作为3D球体内的结构支架。SEM分析显示球体内细胞呈球形，边缘有大量JBNTs连接细胞，细胞间存在相互作用，表明JBNTs模拟ECM的纤维纳米结构促进活跃的细胞-ECM相互作用而不影响细胞-细胞粘附。
3.2 JBNTs在AT-3和NIH-3T3细胞中表现出优异细胞相容性
活/死染色显示，在常规2D培养体系中，AT-3肿瘤细胞和NIH-3T3成纤维细胞与不同浓度JBNTs共培养24小时后，细胞活力均保持在90%以上。Z轴投影显示随JBNTs浓度增加，球体厚度显著增加，40 μg/mL时AT-3球体厚度超过40 μm，NIH-3T3球体超过50 μm，XY平面直径超过100 μm。与传统ULA球体相比，JBNTs诱导的球体中心区域无显著细胞死亡。CCK-8实验显示，低于40 μg/mL的JBNTs显著促进AT-3细胞增殖，10-40 μg/mL浓度范围也显著促进NIH-3T3细胞增殖。综合球体大小和增殖效果，后续实验统一采用30 μg/mL JBNTs。
3.3 细胞球体可通过胰蛋白酶-EDTA消化传代
用0.25%胰蛋白酶消化JBNTs诱导的AT-3球体5分钟后仅解离为小细胞簇，10分钟后仍保持聚集且细胞形态改变。而2.5%胰蛋白酶消化3分钟即可高效将球体解离为单细胞。台盼蓝染色显示，JBNTs组细胞经2.5%胰蛋白酶消化后活力与对照组经0.25%胰蛋白酶消化无统计差异，表明高浓度胰蛋白酶主要消化ECM蛋白而对细胞直接影响较小。细胞计数显示JBNTs来源细胞数量显著高于非JBNTs对照组。重新加入JBNTs后，解离细胞可重新聚集形成新球体，证实该体系支持3D培养的连续传代。
3.4 DNA启发的仿生纳米管创造利于细胞聚集体形成的微环境
免疫荧光染色显示，JBNTs处理组中纤连蛋白、层粘连蛋白、II型胶原和整合素α5的表达显著升高。定量分析显示，与对照组相比，AT-3细胞中纤连蛋白、层粘连蛋白和II型胶原含量分别增加约2倍、3倍和6倍；NIH-3T3细胞中纤连蛋白表达上调1.8倍。整合素α5在AT-3细胞中增加2倍，在NIH-3T3细胞中增加1.6倍。加入5 mM EGTA（金属离子螯合剂）后，预形成的球体在约30秒内解离并明显松散，证实球体后期结构稳定性依赖于功能性整合素-ECM相互作用。Western blot证实JBNTs诱导3D培养条件下纤连蛋白、层粘连蛋白、II型胶原和整合素α5表达均比2D培养高2倍以上，与免疫荧光结果一致。E-钙粘蛋白表达在3D球体中呈上升趋势但未达统计学显著，表明该体系中3D球体形成的主要驱动力是静电相互作用和整合素-ECM相互作用，而非早期E-钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附。
3.5 JBNTs减少U形孔3D球体坏死核心并维持ECM和整合素表达
将JBNTs引入传统ULA板球体培养体系后，活/死染色显示传统ULA球体在24小时培养后出现明显坏死核心，而含JBNTs的ULA球体中央细胞死亡显著减少。Western blot显示，传统ULA球体和ULA-JBNT球体的纤连蛋白和整合素水平均高于2D对照组，但两者之间无显著差异。qPCR分析显示，ULA-JBNT组的Sox9和PIM1基因表达水平显著高于传统ULA球体组，表明JBNTs虽未进一步提高ECM/整合素蛋白水平，但增强了与球体成熟、ECM重塑和细胞存活相关的转录程序。
3.6 3D培养改变AT-3和NIH-3T3细胞基因表达
RNA测序分析显示，JBNTs介导的3D培养条件下AT-3细胞有1,583个差异表达基因（1,540个上调，43个下调）。GO富集分析表明上调基因主要涉及蛋白结合、相同蛋白结合和钙离子结合，并富集于信号转导、细胞分化、多细胞生物发育、细胞粘附、跨膜转运、受体信号通路、磷酸化、凋亡负调控、细胞增殖正调控等多个生物学过程。通路分析显示ECM相关通路富集最显著，在NIH-3T3细胞中同样验证。热图显示AT-3球体中Lama2、Col2a1、Sox9、Ptprf、Pim1、Ptprm和Lgr6等七个关键基因显著上调。其中Lama2和Col2a1的上调与免疫荧光观察到的层粘连蛋白和II型胶原沉积增加一致。Sox9可抑制凋亡并促进ECM积累，Ptprf与整合素相互作用促进纤连蛋白纤维形成，Pim1激酶促进细胞周期进程并抑制凋亡，Ptprm通过RACK1相互作用激活PKC信号增强E-钙粘蛋白依赖性细胞连接，Lgr6有助于形成机械稳定球体。下调基因中UNG（尿嘧啶DNA糖基化酶）和DNA2核酸酶/解旋酶表达降低，提示DNA损伤减少，反映培养系统良好的生物相容性。NIH-3T3细胞分析显示胶原相关基因（Col1a2、Col1a1）和整合素相关基因（Itgb3）协调上调，Sema7a增强整合素依赖性纤连蛋白粘附，Fbln5改善结构维持和机械调控。
五、讨论与结论
讨论部分指出，JBNTs通过静电相互作用快速吸附带负电细胞，建立初始粘附微环境；随后细胞上调整合素和ECM蛋白表达，整合素-ECM相互作用维持球体结构稳定性。JBNTs的纤维状结构模拟天然ECM胶原纤维，提供物理锚定和空间支持。与传统ULA球体相比，JBNTs球体内部结构更松散，有利于物质交换和细胞活力维持。该体系支持高浓度胰蛋白酶消化传代，克服了传统3D培养难以传代的局限。研究结论为：本研究开发了一种基于JBNTs仿生纳米纤维支架的新型3D细胞培养方法，成功在2D培养条件下诱导细胞聚集形成球体。JBNTs首先建立粘附微环境促进细胞锚定和3D结构自组装，在此过程中细胞通过上调整合素、纤连蛋白、层粘连蛋白和II型胶原等关键分子实现稳定球体形成。该系统允许胰蛋白酶消化传代，使3D培养操作简单高效。该方法在肿瘤细胞和成纤维细胞中均表现出良好的跨系统兼容性和操作简便性。但当前研究仍存在局限性：JBNTs调控细胞聚集的具体分子机制尚未完全阐明，需进一步探索关键信号通路激活和细胞间通讯调控；现有系统仅经单种或有限细胞类型验证，无法再现体内复杂多细胞相互作用。未来研究将聚焦优化JBNTs支架功能修饰（如掺入生长因子或其他生物活性分子），并引入多细胞共培养系统以更好模拟体内组织微环境，提升该技术在类器官构建、药物筛选和再生医学中的应用潜力。该论文发表在《Journal of Tissue Engineering》。
