细菌AsmA蛋白在体外介导膜间甘油磷脂转移

《Contact: The Journal of Inter-Organelle Communication》：Bacterial AsmA Proteins Transfer Glycerophospholipids Between Membranes in Vitro

　　

革兰氏阴性细菌由内膜（inner membrane, IM）和外膜（outer membrane, OM）包绕，其甘油磷脂（glycerophospholipids）构建模块在内膜合成，并通过尚不明确的机制重新分布至外膜。在真核生物中，桥样脂质转移蛋白（bridge-like lipid transfer proteins, BLTPs）在膜间转移甘油磷脂，以支持膜稳态和生物发生。细菌AsmA家族蛋白在结构上与BLTPs相关，也被认为具有脂质转移功能。在此，研究人员改造了一种成熟的体外脂质转移实验，提供了AsmA家族蛋白TamB和YhdP具有在膜间转移甘油磷脂能力的生物化学证据，支持AsmA蛋白与BLTPs具有相似功能的观点。

研究背景与存在问题：革兰氏阴性细菌具有内膜（inner membrane, IM）与外膜（outer membrane, OM）双层膜结构，二者之间为周质空间。IM及OM周质小叶的膜构建模块为甘油磷脂（glycerophospholipids），OM外小叶的主要成分为脂多糖。这些脂质均在IM合成后需跨周质转运至OM，其中脂多糖转运机制已被深入研究，而甘油磷脂的转运机制仍不明确。在真核生物中，桥样脂质转移蛋白（bridge-like lipid transfer proteins, BLTPs）在膜接触位点通过其拉长的“桥”结构域（repeating beta groove, RBG）在细胞器间转移甘油磷脂，以支持膜稳态与生物发生。细菌AsmA家族蛋白为周质蛋白，具有类似的桥结构域，且对多种细菌的膜完整性、膜形态、细胞分裂、应激抵抗及毒力至关重要，但一直缺乏其能在膜间转移脂质的生物化学证据。为此，研究人员开展了本项研究。

研究内容与结论：研究人员将成熟的真核BLTPs体外脂质转移实验体系加以改造，用于AsmA家族蛋白研究。在大肠杆菌C43（DE3）细胞中过表达C端六聚组氨酸标签的TamB与YhdP，经Ni-NTA亲和纯化后重构入非离子型两亲聚合物（Non-Ionic Amphipol, NAPol），并以分子排阻色谱（SEC）去除去垢剂。基于FRET的脂质转移实验证实，TamB和YhdP均能转移革兰氏阴性细菌中含量最丰富的两种甘油磷脂——磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）；TamB还能转移心磷脂（cardiolipin, CL）。该研究首次为AsmA蛋白具有膜间脂质转移功能提供了直接生物化学证据，支持AsmA蛋白与真核BLTPs功能相似的观点。论文发表于《Contact: The Journal of Inter-Organelle Communication》。

主要技术方法：①以大肠杆菌K12菌株NEB5-?基因组DNA为模板克隆tamB与yhdP基因，在C43（DE3）菌株中过表达并经Ni-NTA亲和层析纯化；②利用NAPol重构膜蛋白，经SEC置换至无去垢剂缓冲液；③FRET脂质转移实验：供体脂质体含罗丹明/NBD荧光淬灭对，受体脂质体无荧光，二者经His₆-PH系链蛋白连接；④连二亚硫酸盐淬灭实验排除脂质体融合；⑤负染透射电镜（TEM）验证蛋白形貌。

研究结果：①TamB和YhdP介导尾标记甘油磷脂的转移——在供体脂质体含罗丹明/NBD FRET对、受体脂质体无荧光的体系中，加入NAPol重构的TamB或YhdP后NBD荧光显著升高，表明FRET降低、标记脂质从供体转移至受体脂质体。两种蛋白均能转移尾标记的18:1-12:0 NBD-PE与NBD-PG；在头标记18:1 NBD-PE实验中仅TamB能转移该脂质。②对照实验排除非特异效应——相同条件下，NAPol重构的整合膜蛋白酶GlpG未能引起明显FRET降低；无蛋白