《Frontiers in Immunology》：Immunological dysregulation of follicular helper T cells, follicular regulatory T cells, and follicular cytotoxic T cells is associated with disease activity and identifies exploratory immune patterns in rheumatoid arthritis
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**背景：** 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的发生和进展与由生发中心（germinal center，GC）反应失调驱动的自身抗体产生密切相关。滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）、
**背景：** 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的发生和进展与由生发中心（germinal center，GC）反应失调驱动的自身抗体产生密切相关。滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）、滤泡调节性T细胞（follicular regulatory T cells，Tfr）和滤泡细胞毒性T细胞（follicular cytotoxic T cells，Tfc）是滤泡免疫调节的重要组成部分。然而，这三种细胞亚群在RA患者外周血中的循环特征及其临床关联尚未通过系统性研究得到充分探索，且Tfc细胞在RA中的具体功能仍未完全阐明。
**方法：** 本研究收集了41例RA患者和16例健康对照（healthy controls，HCs）的外周血样本。采用改良流式细胞术检测循环Tfh、Tfr和Tfc细胞，旨在系统探讨这些细胞亚群在RA中的临床和免疫学意义。
**结果：** （1）RA患者外周血表现出Tfh/Tfr比值紊乱，并伴有Tfc细胞比例升高，两者均与疾病活动性和自身抗体水平相关。（2）Tfh/Tfr比值和Tfc细胞比例在RA高疾病活动度患者中显著升高。（3）Tfc细胞频率与Tfh细胞频率及可溶性白细胞介素-2受体（soluble interleukin-2 receptor，sIL-2R）水平呈正相关。（4）基于k-means无监督聚类分析，RA患者被分为三种探索性滤泡T细胞相关免疫模式：簇3患者表现出最高的疾病活动性，而簇2患者白细胞计数最低。
**结论：** 循环Tfh/Tfr/Tfc细胞的动态失衡可能反映RA中的免疫失调。Tfc细胞的扩增可能与RA中的系统性免疫激活相关。探索性聚类分析进一步识别出不同的滤泡T细胞相关免疫模式，为RA免疫异质性提供了新的见解。
## 论文解读文章
### 一、研究背景与目的
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以对称性、持续性多关节滑膜炎和侵蚀性关节破坏为特征的慢性系统性自身免疫性疾病。异常自身抗体的大量产生，包括抗瓜氨酸化蛋白抗体（anti-citrullinated protein antibodies，ACPA）和类风湿因子（rheumatoid factor，RF），已被证明在RA的发病和进展中发挥关键作用。尽管RA的确切机制尚未完全阐明，但外周血和滑膜中免疫耐受的失调很可能是异常抗体过度产生的关键驱动因素。
生发中心（germinal center，GC）是B细胞经历克隆扩增、亲和力成熟、类别转换重组和体细胞高频突变的关键微环境，最终产生大量高亲和力抗体和记忆B细胞。RA中自身抗体的产生与淋巴滤泡内GC反应的异常激活密切相关。这一过程的精确调控依赖于GC内滤泡辅助性T细胞（Tfh）与滤泡调节性T细胞（Tfr）之间的动态平衡。Tfh细胞以高表达C-X-C趋化因子受体5（C-X-C chemokine receptor 5，CXCR5）为特征，归巢至B细胞滤泡并通过ICOS-ICOSL轴、CD40L-CD40信号及TCR-肽段-MHC II相互作用与B细胞互作，从而强力促进B细胞成熟和高亲和力抗体的产生。相反，Tfr细胞来源于FoxP3+调节性T细胞前体，通过对Tfh细胞和GC反应的负向调控发挥抑制抗体产生的作用。积累的证据表明，RA患者中Tfh/Tfr失衡与疾病活动性和过度自身抗体产生相关，进而破坏免疫耐受。然而，将RA自身抗体过度产生单纯归因于Tfh/Tfr失衡介导的免疫耐受破坏似乎过于简化。
近年来，除CD4+T细胞亚群外，人类扁桃体中鉴定出一种新型CD8+T细胞亚群，被命名为滤泡细胞毒性T细胞（follicular cytotoxic T cells，Tfc）。本文采用Kristen M. Valentine、Xuwen Zhai等人提出的表型定义，将Tfc细胞鉴定为CD8+CXCR5+PD-1+T细胞。与传统的效应CD8+T细胞不同，Tfc细胞表现出独特的表型和功能异质性。一方面，它们保留了CD8+T细胞固有的细胞毒性潜能，表达颗粒酶和穿孔素；另一方面，它们共表达CD8、CXCR5、共刺激分子（如ICOS、CD40L）和转录因子（如Bcl-6），定位于B细胞滤泡及其邻近微环境，并表现出与Tfh细胞类似的转录谱。在慢性感染或肿瘤微环境中，Tfc细胞被视为前耗竭或干细胞样CD8+T细胞，对PD-1/PD-L1免疫检查点阻断反应良好。然而，它们在自身免疫性疾病中的作用更为复杂。研究表明，原发性干燥综合征和多发性硬化患者外周血中Tfc细胞频率显著增加，并与B细胞和Tfh细胞计数正相关。值得注意的是，在RA发病极早期，局部淋巴组织中Tfh和Tfc细胞频率已升高，并与B细胞计数正相关，但在外周血中尚未检测到这种失衡。因此，需要进一步研究以阐明循环Tfc细胞与RA体液免疫异常及疾病活动性之间的关联。
Tfc细胞与Tfh、Tfr细胞在淋巴滤泡中共定位，可能在GC反应调控中存在交互作用。Tfc细胞可能通过分泌IL-21和参与CD40L/CD40及ICOSL/ICOS途径激活GC B细胞，促进高亲和力IgG和IgM的产生；同时Tfc细胞也被报道对Tfh细胞功能具有正向和负向的调节作用。Tfr细胞作为GC反应的负调控因子，主要抑制Tfh细胞和GC B细胞的活性，也有研究表明Tfr细胞在某些条件下可抑制Tfc细胞增殖。总之，Tfh、Tfr和Tfc细胞并非孤立存在，通过复杂的细胞间通讯和功能串扰，它们可能共同塑造RA中的免疫应答格局。然而，目前关于RA患者外周血中这三种滤泡T细胞亚群的研究仍零散且不系统，它们与疾病活动性和免疫相关参数的整体关系需要进一步阐明。本研究旨在比较RA患者、健康对照及不同疾病活动度RA患者外周血中Tfh、Tfr和Tfc细胞的表达谱，分析其与临床参数的相关性，并进行K-means聚类分析以识别RA患者中探索性的滤泡T细胞相关免疫模式。
### 二、主要技术方法
研究人员从山西医科大学第二医院风湿免疫科招募了41例RA患者和16例健康对照，RA患者均符合2010年ACR/EULAR分类标准。研究人员采用改良流式细胞术检测外周血中循环Tfh、Tfr和Tfc细胞的百分比及绝对计数；采用基于流式细胞术的微量样本多指标流式蛋白定量技术检测血清中sIL-2R、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ和TNF-α的浓度；使用DAS28-ESR系统评估疾病活动度并分组；运用Spearman秩相关分析探讨细胞亚群与临床参数的相关性，采用Benjamini-Hochberg错误发现率方法进行多重比较校正；基于z-score标准化的Tfh%和Tfc%数据进行无监督K-means聚类分析，并通过肘部法则、轮廓系数、层次聚类、bootstrap稳定性分析和共识聚类评估聚类质量。
### 三、研究结果
#### 3.1 临床和人口学特征
41例RA患者和16例健康对照的人口学特征、临床特征和实验室数据总结显示，RA患者与健康对照之间的人口学数据无显著差异。18例非高疾病活动度（non-HDA）和23例高疾病活动度（HDA）RA患者的人口学特征、临床特征、实验室数据和当前用药显示，两组在人口学数据和当前用药方面无显著差异。HDA组患者的TJC、SJC、DAS28和ESR显著高于non-HDA组。
#### 3.2 类风湿关节炎中Tfh/Tfr比值失调和Tfc%扩增
与健康对照组相比，RA组外周血中Tfh%（CD4+T细胞百分比）、Tfc%（CD8+T细胞百分比）和Tfh/Tfr比值均显著升高，而Tfr%显著降低。绝对计数方面，RA组Tfh细胞和Tfc细胞的绝对计数高于健康对照组，而Tfr细胞绝对计数低于健康对照组。
#### 3.3 Tfh/Tfr失衡和Tfc扩增是RA高疾病活动度的特征
与non-HDA组相比，HDA组外周血Tfh%、Tfc%和Tfh/Tfr比值显著升高；Tfr%在两组间无统计学显著差异。两组间Tfh、Tfr、Tfc细胞绝对计数无统计学显著差异。
#### 3.4 RA患者滤泡T细胞亚群与临床参数的关联
经FDR校正后，Tfh%与DAS28评分、Anti-CCP和Anti-MCV水平呈正相关；Tfc%与DAS28评分、RF-IgA、Anti-CCP和Anti-MCV水平呈正相关；Tfh/Tfr比值与总血清IgG浓度呈正相关。
#### 3.5 RA患者Tfh/Tfr/Tfc细胞与细胞因子水平的相关性
经FDR校正后，Tfc%与Tfh%和sIL-2R水平呈显著正相关。
#### 3.6 基于Tfh和Tfc图谱的探索性免疫模式识别
数据集Hopkins统计量为0.663239，表明具有中等聚类倾向。肘部法则确定最佳聚类数K=3。基于z-score标准化的Tfh%和Tfc%，K-means无监督聚类分析识别出三种探索性免疫模式：簇1（n=24）以低Tfh%、低Tfc%为特征；簇2（n=3，占总数的7.3%）以高Tfh%、高Tfc%为特征；簇3（n=14）以中等Tfh%、中等Tfc%为特征。三个聚类的平均轮廓宽度为0.610804，表明聚类分离良好。层次聚类生成了相似的三分支结构，bootstrap重采样显示所有三个聚类的Jaccard相似值均高于0.80，共识聚类支持K=3为合适的聚类方案。
#### 3.7 RA探索性免疫模式间临床特征的比较
三种聚类之间的临床特征比较显示：簇1患者以中年（55.63±11.28岁）和女性（83.3%）为主，Anti-MCV水平最低；簇2患者白细胞计数最低（4.20±1.99×10?/L）；簇3患者压痛关节计数（TJC）最高（20（9-24））且疾病活动度评分（DAS28）最高（6.90（6.30-7.50））。两两比较显示，簇3患者比簇1患者年龄更大、男性比例更高、TJC更高、DAS28更高；簇3患者比簇2患者白细胞计数更高。
#### 3.8 RA探索性免疫模式间细胞因子谱的比较
簇1 RA患者的sIL-2R水平最低；簇3在所有聚类中呈现最高的IL-10水平。两两比较显示，簇3患者比簇1患者具有更高的sIL-2R和IL-10水平；簇2患者的sIL-2R水平也高于簇1患者。
### 四、讨论与结论总结
研究人员发现RA患者外周血呈现Tfh/Tfr失衡和Tfc细胞富集的失调性滤泡T细胞特征，这与疾病活动性和过度自身抗体产生相关。高疾病活动度RA患者的Tfh/Tfr比值和Tfc频率显著升高，提示其可能与疾病活动相关免疫改变有关。Tfc细胞扩增不仅与免疫炎症环境中的关键激活介质sIL-2R呈正相关，还可能对Tfh细胞具有潜在的协同效应。通过基于标准化Tfh/Tfc图谱的探索性K-means聚类分析，RA患者被分为三种免疫模式：簇3（中等Tfh/中等Tfc）与最高疾病活动性相关；簇2（高Tfh/高Tfc）白细胞计数最低。这些发现为RA中滤泡T细胞相关的免疫异质性提供了新的见解。
关于Tfc细胞与免疫激活的关联，研究发现Tfc细胞频率与sIL-2R水平显著正相关。sIL-2R，也称为可溶性CD25（soluble CD25，sCD25），是IL-2Rα链的组成部分，被广泛认为是T细胞激活的关键血清学标志物。这一发现提示循环Tfc细胞频率增加与RA中的免疫激活状态相关。关于Tfc与Tfh的正相关性，两种细胞共享部分转录调控因子包括Bcl6和Tcf1，提示Tfc和Tfh细胞可能具有部分重叠的调控通路和潜在协同效应。
关于探索性免疫模式的解读，簇3患者具有中等水平的Tfh和Tfc却表现出最高的DAS28，而簇2患者尽管Tfh和Tfc比例最高却未表现出最高的疾病活动性，提示疾病活动性可能不仅由单个滤泡T细胞亚群的丰度决定，还反映不同免疫组分之间的平衡和相互作用。簇3患者较高的sIL-2R和IL-10水平可能反映复杂的免疫调节状态。
**研究结论：** 总之，本研究系统描述了RA患者外周血中Tfh/Tfr/Tfc细胞失调的免疫学特征，并证明了它们与疾病活动性、自身抗体水平和免疫激活相关标志物的关联。更重要的是，基于Tfh和Tfc图谱的探索性聚类分析在RA患者中识别出三种具有异质性临床和细胞因子特征的滤泡T细胞相关免疫模式。这些模式可能为RA的免疫异质性提供额外的见解。然而，这些免疫模式的生物学机制和潜在临床意义需要在更大规模的独立队列中验证。
