绿色木霉在污水灌溉及双重生物-非生物胁迫下促进秋葵生长与产量的生物保护作用

《Frontiers in Microbiology》：Bioprotective role of Trichoderma viride in improving Abelmoschus esculentus growth and yield under wastewater irrigation and dual biotic-abiotic stress

　　

灌溉水质显著影响植物生长和生理功能，特别是在生物与非生物胁迫叠加条件下。本研究评估了不同灌溉水类型，即自来水（tap water, TW）、生活污水（domestic wastewater, DWW）、里亚利河水（Lyari wastewater, LWW）和马利尔河水（Malir wastewater, MWW），与从污水中分离的生物保护菌绿色木霉（Trichoderma viride）互作对感染土传病原菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的秋葵（Abelmoschus esculentus）的影响。形态学性状结合ITS扩增子测序及BLAST分析，确认该菌株为绿色木霉（PZ212855）。经LWW与绿色木霉联合处理的植株在农艺和生理性状上表现出显著提升，即株高（101.25 ± 2.87 cm）、鲜生物量（24.04 ± 0.86 g）、干生物量（8.45 ± 0.32 g）、叶片数（20.25 ± 0.75）、果实鲜生物量（14.33 ± 0.55 g）、叶绿素a（2.12 ± 0.04 mg/g F.wt）、叶绿素b（1.30 ± 0.02 mg/g F.wt）、总叶绿素（3.42 ± 0.02 mg/g F.wt）、类胡萝卜素（0.75 ± 0.02 mg/g F.wt）及总可溶性蛋白（1.66 ± 0.02 mg/g F.wt）。这些增加与LWW和DWW较高的养分含量相对应，且符合FAO灌溉标准。DWW提升了植株功能，但其略高的砷浓度需通过根际绿色木霉加以缓解。MWW表现出较高的理化负荷和砷含量，诱导氧化胁迫，使H₂O₂（2.74 ± 0.01 nm/g F.wt）和丙二醛（MDA）（0.97 ± 0.03 nm/g F.wt）升高，并抑制生长。绿色木霉通过调节抗氧化酶活性部分缓解了这些不利效应。总体而言，将富含养分的污水与绿色木霉联合应用，可在胁迫条件下改善植物生长、产量和胁迫耐受性。

《绿色木霉介导的污水灌溉下秋葵生长与产量提升：双重生物-非生物胁迫下的生物保护机制》

一、研究背景与科学问题

全球水资源短缺日益严峻，农业作为水资源消耗的主要部门正面临前所未有的压力。据联合国《世界水发展报告》预测，到2050年约有50亿人口将面临水资源短缺问题，能源和粮食需求预计分别增长约50%和40%。在此背景下，污水回用于农业灌溉受到广泛关注。污水中富含氮、磷、钾等大量元素及微量元素，具有液体肥料的属性，可显著减少化肥施用成本。已有研究报道，利用污水灌溉可使苜蓿种植中化肥需求减少约90%，谷物类作物（小麦、玉米和大麦）减少约40%-50%。然而，工业废水中常含有重金属等有毒污染物，会抑制植物对必需营养元素的吸收并干扰其从根部向地上部的转运，从而影响代谢功能并最终抑制植物生长。传统的重金属去除方法如过滤、化学沉淀、离子交换、反渗透及膜技术等存在成本高、易造成二次污染、缺乏金属结合特异性以及误杀有益微生物等局限性。因此，研究者将目光转向微生物-金属互作策略。真菌具有生物吸附能力，可通过胞内积累和胞外结合实现重金属的解毒与去除，且真菌细胞壁含有较高比例的利于金属结合的组分。与此同时，许多真菌还表现出对植物病原菌的拮抗特性，能够分泌几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶等细胞壁降解酶，其中木霉属（Trichoderma spp.）是公认的生物保护菌，可定殖于植物内部组织而不引起寄主病变，并通过营养获取、次生代谢产物分泌、抗生作用及诱导系统抗性等机制增强植物对生物和非生物胁迫的耐受性。基于此，本研究提出核心假说：将富含养分的污水与绿色木霉（T. viride）协同应用，可在生物与非生物复合胁迫条件下改善秋葵（Abelmoschus esculentus）的生长、产量和胁迫耐受性。

二、主要技术方法

本研究在巴基斯坦卡拉奇地区开展田间盆栽试验，时间为2024年2月至4月。供试土壤为砂质壤土，灭菌后与牛粪按3:1比例混合，每盆装土1 kg，每处理8个重复，出苗后每盆保留2株生长一致的幼苗。研究设置4种灌溉水源（自来水TW、生活污水DWW、里亚利河水LWW、马利尔河水MWW）、3种病原菌处理（无病原菌、尖孢镰刀菌F. oxysporum、立枯丝核菌R. solani）及2种生物保护菌处理（有/无T. viride），采用完全随机设计。污水理化性质分析依据APHA标准方法，元素含量采用原子吸收分光光度计测定。T. viride经形态学观察和ITS1-5.8S-ITS2区域序列的BLAST分析进行鉴定。植物收获后测定农艺性状、产量性状、光合色素含量、总可溶性蛋白、氧化损伤指标（H₂O₂和MDA）及抗氧化酶活性（SOD、CAT、APX、PPO）。数据采用双因素方差分析和Tukey事后检验，并利用Pearson相关分析和层次聚类揭示各指标间的相互关系及处理间的相似性模式。

三、主要研究结果

3.1 灌溉水质特征

水质分析显示，TW、DWW和LWW的pH、电导率（ECw）和总溶解固体（TDS）均处于FAO标准限值内，而MWW的这些参数超出标准。DWW（392.33 mg L^-1）、LWW（411.00 mg L^-1）和MWW（775.33 mg L^-1）的TSS均高于FAO允许范围。大量元素钾、镁和钙在DWW、LWW和MWW中较TW更为丰富；微量元素铁、锌和铜在所有水样中均符合FAO标准。然而，DWW（0.185 mg L^-1）和MWW（0.303 mg L^-1）中的砷浓度超出FAO灌溉水标准限值，其余重金属（铅、镍、镉）均处于允许范围内。总体而言，DWW和LWW符合作物灌溉标准，而MWW因其较高的污染物负荷未达标。

3.2 绿色木霉的形态学与分子鉴定

菌株在PDA培养基上28 ± 2 °C培养7天达70-80 mm直径，菌落初期白色，产孢期转为亮绿色至深绿色，表面棉絮状并具明显同心环纹。显微观察显示菌丝有隔、透明，分生孢子梗大量分支形成金字塔状结构，瓶状产孢梗常呈散开轮生排列，长7-10 μm，分生孢子球形至近球形、壁光滑、绿色，直径3-4 μm。ITS区域BLAST分析确认该菌株为T. viride（一致性≥99%，覆盖度100%），GenBank登录号为PZ212855。

3.3 农艺性状

研究发现DWW和LWW显著促进植株的农艺性状和产量，而MWW则产生不利影响。在LWW灌溉下，病原菌侵染植株经T. viride处理后，根长（34.25 ± 1.49 cm）、根鲜重（3.18 ± 0.14 g）、根干重（2.33 ± 0.09 g）、茎鲜重（16.58 ± 0.50 g）、叶片数（19.00 ± 1.08）、单株果数（3.50 ± 0.29）和果干重（2.89 ± 0.15 g）均显著提升。茎长（54.25 ± 1.65 cm）、茎干重（4.74 ± 0.19 g）、果长（11.89 ± 0.84 cm）和果鲜重（10.27 ± 0.56 g）则在DWW灌溉下改善最为明显。雷达图显示，联合接种处理在所有水质条件下均呈现最宽的响应剖面，表明T. viride与富养分污水之间存在协同增益效应。

3.4 病理学特征

两种病原菌均能侵染秋葵根系并引起病害。TW灌溉下F. oxysporum和R. solani的根系定殖率最高，分别为75.00 ± 0.00%和69.00 ± 3.46%。DWW和LWW灌溉可降低病原定殖率。T. viride的引入进一步显著降低了所有灌溉类型下病原菌在根系上的定殖百分比。其中，LWW灌溉下T. viride使R. solani定殖率降至16.00 ± 3.00%（较TW无T. viride处理降低53%），使F. oxysporum定殖率降至13.00 ± 0.00%（降低62%）。根系定殖指数（RCI）从无双保护菌条件下的4.00降至有T. viride条件下的2.00。

3.5 生理性状

灌溉水质强烈影响光合色素积累。LWW与T. viride联合处理使F. oxysporum侵染植株的叶绿素a达1.88 ± 0.03 mg g^-1 F.wt，R. solani侵染植株达1.71 ± 0.03 mg g^-1 F.wt。叶绿素b在LWW处理下F. oxysporum侵染植株中达1.33 ± 0.01 mg g^-1 F.wt。总叶绿素在LWW处理下较TW病原菌侵染植株提高2.19 mg g^-1 F.wt。总可溶性蛋白方面，LWW（1.46 ± 0.01 mg g^-1 F.wt）和DWW（1.30 ± 0.02 mg g^-1 F.wt）显著高于TW（1.16 ± 0.03 mg g^-1 F.wt），MWW则降低蛋白含量（1.01 ± 0.01 mg g^-1 F.wt）。T. viride与LWW联合处理使F. oxysporum侵染植株蛋白含量达1.56 ± 0.02 mg g^-1 F.wt，R. solani侵染植株达1.58 ± 0.03 mg g^-1 F.wt。

3.6 氧化损伤与抗氧化酶

MWW和TW灌溉下病原菌侵染植株的H₂O₂和MDA水平最高。T. viride与LWW联合处理显著降低了两种病原菌侵染植株的氧化损伤指标：F. oxysporum侵染植株的H₂O₂降至1.72 ± 0.04 nm/g F.wt（较TW对照降低0.87个单位）、MDA降至0.58 ± 0.03 nm/g F.wt（降低0.74个单位）；R. solani侵染植株的H₂O₂降至1.81 ± 0.04 nm/g F.wt（降低1.20个单位）、MDA降至0.50 ± 0.03 nm/g F.wt（降低1.08个单位）。抗氧化酶方面，LWW和DWW灌溉下植株表现为较低的酶活性，MWW则诱导酶活性升高。病原菌侵染提高了抗氧化酶活性，而T. viride的引入在各类灌溉条件下均降低了抗氧化酶活性，其中DWW和LWW灌溉下SOD活性降幅最大，CAT在两种污水灌溉下均降至0.02 units/mg protein，APX和PPO在LWW灌溉下分别降至0.25和0.24 units/mg protein。

3.7 相关性与聚类分析

Pearson相关分析显示，植株生长与产量参数间存在高度显著正相关（p < 0.001），根长与茎长（r = 0.94）、根鲜重（r = 0.96）和根干重（r = 0.94）密切相关。光合色素与总可溶性蛋白间也呈现强正相关，叶绿素a与总叶绿素（r = 0.98）及可溶性蛋白（r = 0.81）显著关联。H₂O₂与MDA（r = 0.812）及所有抗氧化酶（SOD、CAT、APX、PPO，r > 0.84）均呈正相关，MDA与SOD（r = 0.946）和CAT（r = 0.934）的相关性极强。层次聚类分析显示，DWW和LWW与T. viride的联合处理在农艺性状、光合色素和氧化胁迫指标上均形成紧密聚类，表明这两种污水与生物保护菌的组合在胁迫缓解和生长促进方面具有等效且最优的效果。

四、讨论与结论

本研究揭示了污水来源和质量的差异对植物响应具有决定性影响。MWW因其较高的理化参数负荷和砷、镉等有毒元素含量，扰乱了植株的代谢活动和生物合成过程，导致生长迟缓和产量下降。相比之下，LWW和DWW富含必需营养元素，不仅直接促进植物生长，还有助于丰富土壤微生物多样性，改善养分可利用性。T. viride的生物保护功能体现在多重机制：其细胞壁中的几丁质和葡聚糖聚合物可结合重金属，降低其植物可利用性；分泌的β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶可水解病原真菌细胞壁成分，抑制其在根系的定殖；同时还可分泌磷酸盐溶解酶、植物激素和铁载体等促进植物生长。值得注意的是，LWW灌溉下的植株表现始终优于DWW，可能归因于LWW中存在的有益微生物群落与T. viride产生正向互作，促进了养分矿化和根际活性；而DWW中略高的砷浓度（0.185 mg L^-1）可能诱导了额外的氧化胁迫，部分限制了其养分丰度的功能效益。

研究结论表明：污水质量强烈决定植物的生理和生化响应；富含必需营养元素的DWW和LWW可促进秋葵生长和产量提升，而MWW因较高理化胁迫和重金属负荷对植物产生显著抑制效应；生物保护菌T. viride在不同水质条件下均能通过增强生理功能、降低氧化损伤和上调抗氧化活性来改善植株表现。相关性和聚类分析进一步揭示了光合色素、总可溶性蛋白、氧化标志物和防御酶之间的协同响应模式，表明T. viride是通过调控多条代谢通路而非单一属性发挥作用。将T. viride与优质污水（DWW和LWW）联合应用可有效缓解生物和非生物双重胁迫，抑制重金属吸收，增强植株防御机制并控制病害，为污水灌溉系统提供了可持续的作物管理策略。实际应用中，农户可通过灌溉渠道和土壤改良方式引入T. viride接种剂，利用标准混施或施肥灌溉方法，在利用富养分污水灌溉的同时增强作物抗逆性。但本研究存在一定局限性：仅在单一地点和单一生长季开展，结果的外推性受限；仅聚焦于作物的特定生理通路，长期土壤剖面影响和产量稳定性仍待评估。未来研究应涵盖多点、多季节的作物试验，并系统评估污水灌溉对土壤性质、微生物动态和作物产量的长期影响。