《Frontiers in Immunology》：Integrated analysis of isorhamnetin-associated targets in chronic pancreatitis and pancreatic cancer: immune-infiltration associations and antitumor effects in pancreatic cancer cells
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摘要翻译：
目的：慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）可形成炎性胰腺微环境，且是胰腺癌（pancreatic cancer, PC）的既定危险因素。然而，CP与PC之间的免疫-炎症关联仍不清楚。异鼠李素（isorhamnetin,
摘要翻译：
目的：慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）可形成炎性胰腺微环境，且是胰腺癌（pancreatic cancer, PC）的既定危险因素。然而，CP与PC之间的免疫-炎症关联仍不清楚。异鼠李素（isorhamnetin, ISO）是一种具有抗炎和抗肿瘤活性的天然黄酮类化合物，可能影响胰腺炎症信号传导。本研究探讨了CP与PC共有的ISO相关分子网络，考察了优先靶点与转录组估算的免疫细胞浸润之间的关系，并评估了ISO在胰腺癌细胞中的作用。
方法：从疾病数据库收集CP和PC相关靶点，从药物-靶点预测平台获取ISO靶点。利用蛋白质-蛋白质相互作用网络、功能富集和枢纽基因筛选分析疾病及ISO相关靶点。利用TCGA-PAAD、GTEx、Kaplan–Meier Plotter、ROC分析和CIBERSORTx评估枢纽基因的表达、预后相关性、诊断效能及免疫浸润关联。采用分子对接和100 ns分子动力学模拟评估ISO-靶点结合稳定性。双样本孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）探讨遗传代理的六种枢纽蛋白循环水平与CP或PC风险之间的潜在因果关联。在PANC-1和BXPC-3细胞中检测ISO对增殖、伤口闭合、凋亡及靶蛋白表达的影响。
结果：共鉴定出372个CP与PC重叠靶点及48个ISO相关靶点。EGFR、AKT1、MMP9、BCL2、TNF和IL6被筛选为枢纽基因。功能富集表明靶点涉及炎症反应、细胞因子相关信号传导、凋亡调控、上皮增殖、胰腺癌相关通路及PI3K-Akt信号通路。枢纽基因表达与CIBERSORTx估算的免疫细胞亚群（包括活化自然杀伤细胞及多种T细胞亚群）相关。分子对接和分子动力学模拟初步支持ISO-靶点相互作用及复合物稳定性。在12个预设的蛋白质-结局组合中，MMP9-CP是唯一达到名义显著性IVW关联的组合。体外实验中，ISO降低PANC-1和BXPC-3细胞的活力及伤口闭合能力，促进凋亡，并以浓度依赖性方式降低EGFR、AKT1、BCL2和TNF-α蛋白表达。
结论：ISO可能通过涉及EGFR、AKT1、MMP9、BCL2、TNF和IL6的多靶点调控影响CP和PC相关分子网络。这些发现提供了假设生成性的计算、遗传和细胞学证据，支持在胰腺炎症相关肿瘤生物学中研究ISO。然而，免疫调节效应、MMP9/IL6蛋白调控及EGFR/AKT通路激活仍需进一步的实验验证。
论文解读：
慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）是一种由多种遗传和环境因素导致的进行性纤维炎症性疾病，以不可逆的胰腺实质损伤、纤维化和功能减退为特征，严重影响患者生活质量。流行病学显示CP的发病率和患病率在全球范围内呈上升趋势，且缺乏有效治愈手段。更重要的是，CP是胰腺癌（pancreatic cancer, PC）最重要的危险因素之一，显著增加PC发生风险。PC是高度侵袭性的消化系统恶性肿瘤，5年生存率持续低于10%，多数患者确诊时已处于晚期，失去根治性手术机会。目前CP和PC的临床管理主要集中于症状缓解、并发症控制、手术、化疗和放疗等传统手段，但早期诊断困难、疗效有限且化疗耐药问题突出。因此，探索CP向PC转变的分子机制并发现新的干预靶点和治疗策略具有重要的科学意义和临床迫切性。异鼠李素（isorhamnetin, ISO）是一种广泛存在于沙棘、银杏等植物中的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和心脏保护等生物活性。已有研究表明ISO可通过调控PI3K/AKT、MAPK和NF-κB等信号通路抑制多种癌细胞增殖、诱导凋亡并抑制迁移和侵袭。由于CP和PC的病理生理过程均涉及慢性炎症、氧化应激和细胞增殖失控，ISO可能成为干预CP相关病理进展和PC发生的候选分子。然而，ISO是否直接影响CP和PC及其潜在分子靶点和精确机制尚缺乏系统研究。与以往主要研究ISO在胰腺癌细胞中直接抗增殖或促凋亡作用的研究不同，本研究创新性地构建了整合CP-PC导向的分析框架，结合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟、孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）、免疫浸润分析和细胞实验，从系统层面探讨ISO与炎症相关胰腺肿瘤生物学的关联。
研究人员首先从GeneCards、DisGeNET、OMIM和TTD数据库获取CP和PC相关靶点，从CTD、PharmMapper、ETCM、SEA和SwissTargetPrediction数据库预测ISO潜在靶点。通过维恩图获得CP与PC共享的372个重叠靶点，以及与ISO相关的48个交叉靶点。利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并通过Cytoscape的CytoHubba插件中的Degree、EPC、MCC和Betweenness四种算法筛选枢纽基因。采用clusterProfiler包进行GO和KEGG富集分析。基于TCGA-PAAD和GTEx数据库分析枢纽基因在PC组织与正常组织中的mRNA表达差异；利用Kaplan–Meier Plotter进行总生存期（overall survival, OS）分析；使用pROC包进行受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线分析；应用CIBERSORTx算法评估枢纽基因表达与免疫细胞浸润的相关性。分子对接使用AutoDock Vina进行，分子动力学模拟（molecular dynamics simulation, MDS）使用YASARA软件进行100 ns全原子模拟，计算RMSD和RMSF。两样本MR分析利用IEU OpenGWAS数据库中的蛋白质GWAS汇总数据（来源为INTERVAL研究，包含3301名欧洲血统参与者）作为暴露，CP结局来自FinnGen（Finn-b-K11_CHRONPANC，1737例病例和195144例对照），PC结局来自GWAS目录（ebi-a-GCST90018893，1196例病例和475049例对照），采用逆方差加权（inverse variance weighted, IVW）作为主要估计方法，并以MR-Egger、加权中位数等方法进行敏感性分析。体外实验使用人PC细胞系PANC-1和BXPC-3（购自武汉普诺赛生命科技有限公司），通过CCK-8法检测细胞活力，Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡，划痕实验评估伤口闭合能力，Western blot检测EGFR、AKT1、BCL2和TNFα蛋白表达。
研究结果显示，CP和PC共享372个靶基因，GO富集分析表明这些基因显著富集于上皮细胞增殖、DNA修复复合物和mRNA碱基配对翻译后抑制活性等条目；KEGG富集显示主要涉及胰腺癌、PI3K-Akt信号通路等。PPI网络分析结合四种算法鉴定出EGFR和TP53为CP与PC共同的关键枢纽基因。在ISO-CP-PC交叉靶点分析中，共获得48个重叠靶点，KEGG富集分析显示胰腺癌通路排名第一。通过MCODE模块分析和四种算法交叉，最终确定BCL2、AKT1、IL6、EGFR、MMP9和TNF为ISO影响CP-PC的六个枢纽基因。在PC组织表达分析中，TCGA-PAAD和GTEx数据显示这六个基因的mRNA表达水平均显著高于正常胰腺组织。Kaplan–Meier生存分析显示，AKT1高表达与较长OS相关，而MMP9、EGFR和IL6高表达与较短OS相关。ROC曲线显示六个枢纽基因具有一定区分PC组织与正常组织的能力，但该结果需外部验证。CIBERSORTx免疫浸润分析发现，枢纽基因表达与活化自然杀伤细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和T辅助2细胞等多种免疫细胞亚群的估算比例相关。
分子对接结果显示，ISO与AKT1（结合能-9.6 kcal/mol）、MMP9（-9.3 kcal/mol）、EGFR（-8.4 kcal/mol）、TNF（-8.4 kcal/mol）、BCL2（-7.1 kcal/mol）和IL6（-7.0 kcal/mol）均表现出较好的预测结合亲和力，其中与AKT1结合能最低。分子间相互作用包括常规氢键、碳-氢键和π-烷基相互作用等。100 ns分子动力学模拟的RMSD和RMSF分析显示，各ISO-靶蛋白复合物整体构象稳定，能量维持在较低水平。MR分析中，在12个预设组合中，仅遗传代理的MMP9循环蛋白水平与CP风险存在名义显著关联（14个SNP，OR=1.181，95%CI：1.042-1.338，名义P=0.0093），径向IVW和最大似然法也观察到相似趋势。Cochran's Q检验未显示显著异质性，MR-Egger截距检验未提示水平多效性，留一法分析表明结果不受单个SNP驱动。
体外细胞实验方面，CCK-8实验显示ISO以浓度依赖性方式显著降低PANC-1和BXPC-3细胞的活力（P<0.001）。基于GO/KEGG富集结果与枢纽基因的交叉分析确定EGFR为唯一重叠基因，提示EGFR可能是ISO干预CP-PC病理过程的重要靶点。Western blot结果显示，随着ISO浓度增加，EGFR、AKT1、BCL2和TNFα的蛋白表达水平在两种细胞系中均显著下调。划痕实验显示ISO处理显著降低两种细胞的伤口闭合率（P<0.001），但该效应可能同时受增殖和迁移影响。流式细胞术检测发现ISO以浓度依赖性方式显著增加两种细胞的凋亡率（P<0.001），80 μM组凋亡率最高。
讨论部分指出，本研究通过网络药理学、分子对接、分子动力学模拟、MR分析和体外实验，系统探讨了ISO干预CP-PC相关病理过程的潜在分子机制。EGFR和TP53作为连接CP和PC的枢纽基因具有生物学合理性，EGFR信号在细胞增殖和存活中发挥核心作用，TP53功能失活与基因组不稳定和慢性炎症向恶性转化相关。PI3K-Akt通路可能是连接CP慢性炎症微环境与PC失控增殖的分子桥梁。六个枢纽基因（BCL2、AKT1、IL6、EGFR、MMP9和TNF）涵盖了炎症、增殖、存活、凋亡抵抗和组织重塑等多个关键过程。AKT1高表达与较好OS的看似矛盾结果应谨慎解读，因为AKT信号活性主要取决于磷酸化状态而非mRNA或总蛋白水平，且PC存在分子异质性。免疫浸润分析提示枢纽基因表达与免疫细胞浸润存在关联，但不能证明ISO直接调控免疫细胞功能。MR分析中MMP9-CP的名义关联提示MMP9可能通过降解基底膜和细胞外基质、破坏组织结构完整性、促进炎性细胞浸润而加重慢性损伤和纤维化，但需注意该结果未经过多重校正，属于假设生成性证据。
研究结论：本研究提供了一个整合的、假设生成性的框架，提示ISO可能与CP和PC相关分子网络、炎症相关及免疫浸润相关特征、凋亡、上皮增殖、细胞外基质重塑和PI3K-Akt相关通路相关联。EGFR、AKT1、MMP9、BCL2、TNF和IL6被确定为连接胰腺炎症和肿瘤相关生物学过程的潜在分子节点。细胞实验显示ISO降低PC细胞活力、减少伤口闭合、促进凋亡，并降低EGFR、AKT1、BCL2和TNFα总蛋白丰度。然而，本研究未直接验证免疫功能效应、MMP9或IL6蛋白变化、EGFR/AKT磷酸化状态、下游通路激活或非增殖依赖性迁移。此外，对接和分子动力学结果需要进一步的计算和生物物理验证，基于ROC的诊断意义需要独立的外部验证。因此，这些发现应谨慎解读，并需要在炎症性胰腺模型、免疫细胞系统、动物研究和临床样本中进一步确认。
