基于表型的高内涵筛选鉴定靶向微生物生长、生物被膜及群集运动活性的植物提取物

《Frontiers in Microbiology》：Phenotypic high-content screening identifies plant-derived extracts targeting microbial growth, biofilms and swarming activity

　　

摘要：抗菌药物耐药性的加剧凸显了对新型抗菌剂尤其是天然来源抗菌剂的迫切需求。本研究对200种水性植物提取物进行了针对六种临床相关病原菌的抗菌活性筛选。受试菌株包括：大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC35401、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）DSM19882、肠道沙门菌肠道亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium）ATCC14028、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）NCCB32030、变形链球菌（Streptococcus mutans）DSM20523和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）DSM2570。研究人员使用三种益生乳酸杆菌（副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）、植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和鼠李糖乳杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus））以区分病原体特异性活性与广谱抑制活性。抗菌活性首先采用琼脂纸片扩散法评估，随后通过肉汤微量稀释法测定活性植物提取物的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）和最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）。此外，还评估了提取物对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和变形链球菌生物被膜形成的影响，以及对铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门菌群集运动能力的影响。21种提取物在纸片扩散试验中抑制了至少一种病原菌。19种提取物检测到明确的MIC值，而仅5种表现出杀菌活性。除已知抗菌植物大蒜（Allium sativum）和熊葱（Allium ursinum）外，此前未见报道的欧洲栗（Castanea sativa）、黑加仑醋栗×鹅莓杂交种（Ribes × nidigrolaria）和裂叶黑莓（Rubus laciniatus）叶片提取物对受试病原菌显示出良好的活性。这些提取物不仅能抑制细菌生长，还能在亚抑制浓度下减少某些病原菌种的生物被膜形成和群集运动。值得注意的是，在纸片扩散试验中未检测到对乳酸杆菌生长的抑制作用。总体而言，研究结果凸显了水性植物提取物作为抗菌和抗毒力活性来源的潜力，并证明了病原体特异性效应在发现植物源抗菌剂中的重要性。

论文解读文章

### 研究背景与目的
随着抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）问题日益严峻，全球范围内对新型抗菌剂的需求愈发迫切。传统抗生素在食品生产和临床治疗中的过度使用不仅导致食品中抗生素残留，还加速了耐药基因的传播。世界卫生组织已发布耐药菌优先清单，以指导新型抗菌药物的研发。在此背景下，植物提取物因其天然来源、安全性及可生物降解性，被视为传统抗生素的潜在替代方案。植物中的次级代谢产物如生物碱、酚类化合物和萜类化合物可直接发挥抗菌作用，或通过干扰细菌毒力机制来增强现有抗生素的效力。然而，以往研究多集中于少数植物种类、单一病原菌或纯化合物，缺乏系统性的多病原菌筛选。此外，传统抗菌评估多仅关注生长抑制，而对亚抑制浓度下抗毒力活性（如抑制生物被膜形成和群集运动）的考察不足。因此，本研究开展了一项高内涵筛选，系统评估200种不同温度制备的水性植物提取物对六种临床和食品相关致病菌的抗菌活性，并进一步分析其对生物被膜形成和群集运动的影响，同时考察提取物对益生乳酸杆菌的选择性，以期为食品和饲料领域的抗菌策略提供应用导向的数据支持。

### 主要技术方法
研究者从奥地利上奥地利州采集植物材料，经干燥、研磨后分别采用22 ℃冷提和70 ℃热提两种方式制备水性提取物，最终获得质量/溶剂比为1:10的提取物储备液。抗菌活性初筛采用EUCAST纸片扩散法，针对六种病原菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、变形链球菌、粪肠球菌）及三种益生乳杆菌。阳性提取物进一步通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。抗生物被膜活性采用结晶紫染色法在96孔板中定量，针对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和变形链球菌；群集运动抑制实验在半固体琼脂平板上进行，针对铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门菌。此外，采用人Caco-2细胞系通过刃天青还原法评估提取物细胞毒性。对具有新颖活性的加仑子×醋栗杂交种（Ribes × nidigrolaria）叶片提取物，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行植物化学成分表征，并以标准品验证主要化合物。

### 研究结果
**3.1 提取物的抗菌活性**
经纸片扩散法初筛，21种提取物对至少一种病原菌显示抑菌圈，涉及大蒜、熊葱、芹菜、欧洲栗、芝麻菜、草莓、留兰香、牛至、加仑子×醋栗杂交种、黑莓及裂叶黑莓等植物。其中9种植物物种的冷、热提取物均有活性，而芝麻菜、留兰香和黑莓仅在热提物中显示活性。所有活性提取物对三种乳杆菌均无抑制作用。随后微量稀释法测定显示，19种提取物具有明确MIC值（0.39%–50%），仅5种表现出杀菌活性。革兰氏阳性菌尤其变形链球菌和金黄色葡萄球菌对提取物更为敏感；变形链球菌是最易感的菌株。铜绿假单胞菌仅被大蒜和熊葱提取物抑制，且MIC与MBC一致。欧洲栗、裂叶黑莓和加仑子×醋栗杂交种叶片提取物表现出值得关注的抑制谱。

**3.2 提取物的抗生物被膜活性**
针对大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌和变形链球菌的定量分析显示，提取物呈现物种特异性和部分相反的效应。热提欧洲栗提取物使变形链球菌和生物被膜分别减少88%和94%，但在鼠伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌中却促进生物被膜形成。冷提裂叶黑莓提取物完全抑制变形链球菌生物被膜，但刺激另外两种菌。加仑子×醋栗杂交种冷提物增强革兰氏阳性菌生物被膜，但使大肠杆菌生物被膜降低40%。大蒜和熊葱提取物在多数受试菌株中表现出一致的抗生物被膜活性。留兰香热提物和所有牛至提取物使变形链球菌生物被膜减少82%–90%。

**3.3 群集运动抑制**
针对鼠伤寒沙门菌和铜绿假单胞菌的群集运动试验显示，大蒜、熊葱、欧洲栗、加仑子×醋栗杂交种和裂叶黑莓提取物能在不影响细菌生长的浓度下抑制群集运动。鼠伤寒沙门菌对大蒜和熊葱最敏感，3%大蒜提取物即可完全阻断群集（但结果不稳定）。铜绿假单胞菌需要更高浓度（熊葱4%–5%）。欧洲栗在6.25%时抑制鼠伤寒沙门菌群集运动；而加仑子×醋栗杂交种和裂叶黑莓提取物对两种菌均有抗群集活性。

**3.4 Caco-2细胞毒性评估**
所有受试阳性提取物在1%浓度下均使细胞活力保持在90%以上，表明在测试条件下无细胞毒性。

**3.5 Ribes × nidigrolaria叶片提取物的植物化学组成**
LC-MS/MS分析首次揭示加仑子×醋栗杂交种叶片提取物的主要成分为槲皮素糖苷衍生物、山柰酚糖苷衍生物、异鼠李素糖苷衍生物及咖啡酸。定量结果显示，芦丁浓度最高（284 μg/mL），其次为槲皮素-3-O-(6″-O-丙二酰)-β-D-葡萄糖苷（214.5 μg/mL）、异槲皮苷（162.5 μg/mL）、烟花苷（91.5 μg/mL）、山柰酚-3-O-葡萄糖苷（56.7 μg/mL）、水仙苷（48.8 μg/mL）、咖啡酸（38.5 μg/mL）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（17.9 μg/mL）。

### 讨论与结论
本研究表明，多种水性植物提取物具有明显的抗菌和抗毒力活性。大蒜和熊葱提取物对全部受试病原菌均显示强抑制作用，这与它们含有水溶性含硫化合物有关。革兰氏阳性菌更易感，而粪肠球菌的耐受性可能与其外排泵等适应机制有关。提取物对益生乳杆菌无抑制作用，表明其可能用于选择性抑制病原菌而保留有益菌群。欧洲栗、裂叶黑莓和加仑子×醋栗杂交种叶片提取物展示出新颖的抗生物被膜和抗群集运动活性，且首次报道了加仑子×醋栗杂交种叶片的植物化学组成。这些提取物中的黄酮类化合物（如槲皮素及其糖苷）可能介导了所观察到的抗菌和抗毒力效应，但具体机制仍需通过生物测定引导的分离纯化来确证。研究局限性包括生物被膜试验仅对部分病原菌可靠、群集运动仅适用于两种运动菌、缺乏微观或分子层面的分析等。总之，水性植物提取物可作为传统抗菌剂的应用导向替代品，尤其在食品和饲料领域具有潜力，但实际应用前仍需深入研究其作用机制、复杂体系中的有效性及毒理学安全性。

### 结论部分翻译
总之，本研究证明了所选植物提取物对临床相关病原菌具有显著的抗菌和抗毒力功效。虽然强烈的生长抑制主要见于大蒜和熊葱提取物，但多种其他水性提取物在亚抑制浓度下减少了生物被膜形成和/或群集运动，凸显了其减弱致病性的潜力。值得注意的是，欧洲栗、裂叶黑莓和加仑子×醋栗杂交种的叶片提取物显示出有前景的抗生物被膜和抗群集运动活性。据研究人员所知，裂叶黑莓和加仑子×醋栗杂交种叶片提取物的抗菌和抗毒力活性此前尚无报道。活性成分的详细鉴定仍是未来研究的课题。在纸片扩散试验中，提取物对病原菌具有选择性作用而不抑制益生乳酸杆菌，表明其适用于食品和饲料应用。总体而言，研究结果支持水性植物提取物作为传统抗菌剂的有前景且应用导向的替代方案，在实际使用前需要进一步研究其作用机制、在复杂系统中的功效及毒理学安全性。