硫自养反硝化过程中硫氧化菌 Thiobacillus 依赖电子受体的氧化亚氮代谢二重性

《Frontiers in Microbiology》：Electron acceptor-dependent duality of nitrous oxide metabolism in Thiobacillus during sulfur autotrophic denitrification

　　

硫驱动自养反硝化（SADN）是一种用于低碳废水脱氮的有前景生物技术；然而氧化亚氮（N2O）排放仍是显著环境问题。研究人员通过连续富集培养系统考察了不同氮氧化物电子受体对反硝化性能、微生物群落演替、N2O还原酶基因 nosZ 分支分布及 Thiobacillus 生态功能的影响。在测试条件中，硝酸根（NO3?）投加体系实现最高反硝化与硫氧化速率及最低净 N2O积累，而亚硝酸根（NO2?）投加因 N2O 产消失衡导致严重 N2O 积累。高通量测序与定量 PCR 显示 Thiobacillus 在 NO3?、NO2? 及一氧化氮存在下成为主导硫氧化反硝化菌，伴随 nirS 与 I 支 nosZ 基因显著富集；N2O 投加则促进功能多样群落及含 II 支 nosZ 的 Azonexus 与 Dechloromonas 富集。宏基因组恢复三株 Thiobacillus MAG（MAG 10、11、25），MAG 10 具完整硫氧化与反硝化基因（含 I 支 nosZ、nirS），MAG 11 缺 nosZ 但留 norB/norC 提示产 N2O 潜力，MAG 25 在 N2O 投加下表现 N2O 响应性功能富集。结果表明电子受体塑造微生物演替、nosZ 分支分布及 Thiobacillus 在 N2O 循环中的条件依赖二重角色，为 SADN 工艺减排提供新见解。

研究背景方面，氧化亚氮（N₂O）是大气第三大温室气体且破坏臭氧，全球变暖潜势为 CO₂ 的 265 倍，废水处理厂排放近四十年增 30%。生物脱氮中 N₂O 既为硝化副产物亦为反硝化中间体，严格出水标准下减排压力增大。硫自养反硝化（SADN）以还原态硫为电子供体、氮氧化物为电子受体，无需外加有机碳、污泥量少且 N₂O 转化率仅 0.3%?0.6%，但不同运行条件下 N₂O 累积的微生物基础不清。Thiobacillus 属作为 SADN 核心硫氧化反硝化菌，传统被认为具完整反硝化通路而充当 N₂O 汇，但新证据表明其可随条件转为源或汇，物种水平机制不明，且 nosZ 分 I、II、III 支，I 支多见于典型硫氧化反硝化菌，II 支关联非典型高亲和 N₂O 还原菌，电子受体如何驱动两分支互作尚未知晓。该研究即在《Frontiers in Microbiology》发表，旨在以连续富集揭示电子受体对 SADN 性能、群落、nosZ 分支及 Thiobacillus 功能分化的影响。

关键技术方法上，研究人员以市政污水厂活性污泥为接种物，在血清瓶批次体系中分别以 NO₃^?、NO₂^?、NO(g)、N₂O(g) 为唯一氮氧化物电子受体、Na₂S·9H₂O 供 S^2?，氦气顶空，30 ℃ 避光连续转接两次亚培养；结合 16S rRNA V4 区扩增子测序、靶向 nirS/nirK 及 I/II 支 nosZ 的定量 PCR、MetaWRAP 流程宏基因组共组装与单组装回收 MAG，并以 TPM 归一化映射reads分析基因丰度，所有统计与绘图辅以 SPSS 与 OriginPro。

研究结果部分，3.1 反硝化与硫氧化速率小节通过批次活性计算发现第二次亚培养中 NO₃^? 组 NO₃^? 消耗率达 2.41 mg-N/g-VSS/h、硫氧化 1.71 mg-S/g-VSS/h 且净 N₂O 积累最低（0.007 与 0.006 mg-N/g-VSS/h 产消），NO₂^? 与 NO 组产 N₂O 远超限量还原致净积累高，N₂O 组仅表现消耗速率提升（0.01→0.12 mg-N/g-VSS/h），证明 NO₃^? 条件最利减排。3.2 微生物群落组成与多样性小节经 PCA 与热图指出 Thiobacillus（ASV_2294）在 NO₃^?、NO₂^?、NO 组二次富集后相对丰度升至 65.8%、75.5%、84.0%，N₂O 组反降至 8.7% 且 Shannon 指数在 NO 组最低（1.07），说明 NO 选择压最强、N₂O 维持多样群落。3.3 富集过程 nir 与 nosZ 基因拷贝数小节用 qPCR 显示二次富集后 nirS 与 I 支 nosZ 拷贝升 4.10?5.96 倍（NO 组最显），II 支 nosZ 亦增但量级低，nirK 变化边际，表明 nirS 型与 I 支 nosZ 菌被定向富集。3.4 Thiobacillus 与 nir/nosZ 数量关系小节经对数回归与 Spearman 相关得出 Thiobacillus 丰度与 I 支 nosZ 拷贝 R²=0.94、与 nirS R²=0.81，与 II 支 nosZ R²=0.80 较弱，证 Thiobacillus 主要承载 I 支 nosZ，II 支归 Dechloromonas、Stenotrophomonas 等他属。3.5 不同反硝化条件宏基因组群落偏移小节从 76 个高质量 MAG 中定出 MAG 10（Thiobacillus sp. 001899775，完 80.3%）在 NO₃^?/NO₂^?/NO 占 51?59%、N₂O 下仅 1%；MAG 11（完 84.0%，ANI 72.6% 为新种）仅 NO₃^? 下 1.2%；MAG 25（Thiobacillus thioparus，完 77.2%）在 N₂O 下最高 1.8%；N₂O 组并存 Sulfuricystis、Azonexus、Phosphoribacter 等异养菌。3.6 关键 MAG 差异功能基因与代谢路径小节注释出 MAG 10 带 sqr-dsr-apr-sat-sox 全硫氧化与 nap-nirS-norB-I支nosZ 全反硝化及 petAB 电子链、CBB 固碳（rbcL/rbcS），无 mdh；MAG 11 有 nap-nirS-norB 但无 nosZ（基因组缺否存疑），止步 N₂O；MAG 25 具 nirK 与全反硝化、缺 petAB 仅 ccoP，三株皆严自养。3.7 不同电子受体下 Thiobacillus MAG 基因丰度小节以 TPM 示 MAG 10 在 NO₃^?/NO₂^?/NO 下硫氧化、CBB、电子传递、反硝化各基因 TPM 均数百级，N₂O 下骤降至 20 余；MAG 11 在 NO₂^? 与 NO 下 aprA 单基因跳升（225/270）而 aprB 近零；MAG 25 在 NO₃^?/NO₂^?/NO 下极低、N₂O 下略升，反映条件依赖表达分化。

讨论与结论翻译总结：研究人员指出电子受体是决定 SADN 中微生物演替、nosZ 分支分布及 Thiobacillus 在 N₂O 循环中二重角色的关键因子——NO₃^? 偏好完整反硝化 Thiobacillus（MAG 10 类）故 N₂O 汇强，NO₂^?/NO 中间态因 nirS/I支nosZ 富集但产 N₂O 速率更高而净排放，N₂O 自身作受体则筛选 II 支 nosZ 非硫氧化菌（Azonexus、Dechloromonas）与特化 N₂O 还原 Thiobacillus（MAG 25）共存；同属内 MAG 10 完备、MAG 11 可能截断于 N₂O、MAG 25 专性响应 N₂O 还原，说明种级谱系而非单纯基因表达切换主导功能柔性。该工作为工程硫基脱氮体系通过调控电子受体序列（先 NO₃^? 后控 NO/NO₂^? 峰值）抑制 N₂O 排放提供微生物生态依据。