酶替代疗法（ERT）联合瞬时低剂量甲氨蝶呤（TLD-MTX）在婴儿型与晚发型庞贝病患者中诱导年龄与疾病依赖的免疫谱改变

《Frontiers in Immunology》：Enzyme replacement therapy (ERT) combined with transient low-dose methotrexate (TLD-MTX) results in age- and disease-dependent immune profile changes in Infantile- vs. late-onset Pompe disease patients

　　

背景：瞬时低剂量甲氨蝶呤（TLD-MTX）可在庞贝病中诱导针对酶替代疗法（ERT）的长期免疫耐受，但其免疫学机制尚不清楚。研究人员假设，在接受了ERT治疗的婴儿型庞贝病（IOPD）与晚发型庞贝病（LOPD）患者中，TLD-MTX可降低免疫活化并诱导调节性表型。方法：研究人员采用多参数流式细胞术，对基线及治疗后6个月采集的外周血单核细胞（PBMC）进行评估，分析了40项免疫参数，包括（1）13例未配对样本，来自ERT+MTX未治疗（n=10）与已治疗（n=3）的IOPD患者；（2）6例LOPD患者的配对治疗前后样本。采用线性回归分析免疫参数与以尿葡萄糖四糖（Glc4，糖原降解产物）衡量的疾病活动度之间的相关性。结果：在IOPD中，ERT+MTX治疗样本（中位年龄12.3个月）显示CD16+单核细胞比例降低，经典CD14+CD16?单核细胞增加，提示向低活化免疫谱偏移；未治疗样本成熟记忆B细胞比例更高，浆母细胞、中央记忆CD4+与CD8+ T细胞以及TIGIT+ CD8+ T细胞比例更低。相反，LOPD患者（中位年龄51.5岁）治疗后B细胞比例下降，TIGIT+ CD4+ T细胞比例上升。基线Glc4水平IOPD高于LOPD（42.5对7），两组经ERT+MTX后均下降。在未治疗IOPD中，Glc4与CD16+单核细胞、成熟记忆B细胞及终末分化CD8+ T细胞正相关，治疗后上述关联消失。LOPD中，滤泡调节性T细胞（Tfr）与治疗前Glc4相关而治疗后不相关，未见其他显著相关。讨论：上述结果揭示了IOPD与LOPD在ERT+MTX治疗前后不同的免疫谱。IOPD中促炎单核细胞与记忆T细胞减少，提示免疫活化降低；LOPD中TIGIT+ CD4+ T细胞增加可能反映参与免疫耐受的调节机制。

研究背景与立项依据

庞贝病（糖原贮积病Ⅱ型，OMIM 232300）是一种由酸性α-葡糖苷酶（GAA）缺乏所致的常染色体隐性溶酶体贮积病，糖原在心肌、骨骼肌和平滑肌内蓄积导致进行性肌无力，按起病年龄分为婴儿型庞贝病（IOPD）与晚发型庞贝病（LOPD）。重组人GAA（rhGAA；alglucosidase alfa）酶替代疗法（ERT）虽改变了疾病自然史，但疗效受起始年龄、交叉反应免疫物质（CRIM）状态及抗rhGAA IgG高滴度（HSAT）影响。既往免疫耐受诱导（ITI）多采用利妥昔单抗联合甲氨蝶呤（MTX）和IVIG，但利妥昔单抗引起广泛且持久的B细胞耗竭且可及性有限。瞬时低剂量甲氨蝶呤（TLD-MTX）作为新方案在IOPD中已显示安全可行，然而其诱导耐受的免疫机制不明，且IOPD与LOPD在ERT起始时的免疫表型特征尚未被刻画。为此，研究人员在ERT初治背景下分析TLD-MTX对两型患者免疫状态的影响，论文发表于《Frontiers in Immunology》。

主要关键技术方法

研究纳入ERT初治且联合TLD-MTX的LOPD配对队列（6例，自身前后对照）与IOPD非配对队列（10例未治疗对照+3例ERT+MTX治疗者），采集基线及约6个月外周血，分离血浆与外周血单核细胞（PBMC）冻存。由Duke Immune Profiling Core采用多参数流式细胞术（两板抗体组合）定量先天与适应性免疫细胞亚群频率；尿葡萄糖四糖（Glc₄）经LC-MS/MS定量；抗rhGAA IgG滴度由Sanofi或LabCorp测定；统计采用Mann–Whitney U（非配对）、Wilcoxon配对符号秩（配对）及简单/多重线性回归（校正年龄），以P<0.05为显著。

研究结果

3.1 患者队列与治疗概况

IOPD治疗组中位采样年龄12.3个月，未治疗组4.5个月；LOPD配对样本中位采样年龄50.9岁（前）与51.5岁（后），间隔约6.1个月。TLD-MTX为ERT首剂起每周或隔周给MTX（0.4 mg/kg/日×3日×3周期，共9剂），IOPD口服2.5–10 mg分级减量，LOPD口服10 mg。所有患者持续ERT（20 mg/kg隔周或每周）。IOPD中Glc₄治疗前3个月锐降；LOPD中Glc₄呈下行趋势未回基线。

3.2 免疫表型分析

3.2.1 IOPD队列

3.2.1.1 单核细胞与树突状细胞：治疗组CD14⁺单核细胞占先天门比例升高（81.33%对63.53%，P=0.018），HLA-DR⁺CD14^?树突状细胞降低（6.54%对15.66%，P=0.028）；经典CD14⁺CD16^?单核细胞升高（98.23%对88.66%，P=0.014），CD16⁺（中间+非经典）单核细胞降低（1.58%对8.44%，P=0.028），提示向低活化偏移。

3.2.1.2 B细胞：治疗组浆母细胞（CD19⁺CD27⁺IgD^?CD20^?CD38⁺⁺）占IgD^? B细胞比例降至2.48%对11.68%（P=0.049），成熟记忆B细胞（CD19⁺IgD^?CD27⁺）占B细胞升至3.95%对1.61%（P=0.045）。

3.2.1.3 T细胞：治疗组中央记忆CD4⁺ T细胞占CD4⁺门6.86%对13.12%（P=0.042），中央记忆CD8⁺ T细胞占CD8⁺门2.10%对11.09%（P=0.028），均显著下降。

3.2.1.4 调节性亚群：Treg、Tfh、Tfr及Th1/Th2/Th17比例无显著差异。

3.2.1.5 抑制性受体：治疗组TIGIT⁺ CD8⁺ T细胞占CD8⁺门0.49%对2.25%（P=0.011）下降，PD-1⁺无差异；TIGIT⁺ CD8⁺中中央记忆组分同步降低。

3.2.1.6 疾病活动与年龄：未治疗IOPD中Glc₄随年龄（1–17月）上升（β=57.394，P=0.007），治疗后该相关消失且Glc₄整体低于治疗前（P=0.017）。

3.2.1.7 Glc₄与免疫谱关联：未治疗组中Glc₄与CD16⁺单核细胞、成熟记忆B细胞、TEMRA CD8⁺ T细胞正相关，与经典单核细胞、初始B细胞、浆母细胞、中央记忆CD8⁺ T细胞负相关；治疗后关联不复存在。

3.2.2 LOPD队列

3.2.2.1 B细胞：治疗后总CD19⁺ B细胞占淋巴细胞降至9.77%对14.32%（P=0.032），成熟记忆B细胞占B细胞升至15.32%对12.88%（P=0.046），浆母细胞占IgD^? B细胞升至5.38%对2.22%（P=0.046）。

3.2.2.2 T细胞与其他：TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞占CD4⁺门升至2.26%对1.69%（表2趋势一致）；Tfr与治疗前Glc₄相关而治疗后不相关，余亚群无持续显著变化。

讨论与结论翻译

讨论指出，本研究首次在庞贝病患者中评估TLD-MTX的免疫调节效应，揭示IOPD与LOPD存在年龄与疾病依赖的免疫谱重塑。IOPD中促炎CD16⁺单核细胞减少与记忆T细胞下调提供免疫活化减弱的证据；LOPD中TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞上调可能体现贡献于免疫耐受的调节机制。结论部分明确：ERT+TLD-MTX在IOPD中使单核细胞谱向经典低活化偏移、浆母细胞减少而成熟记忆B细胞相对累积、中央记忆T细胞与TIGIT⁺ CD8⁺ T细胞下降，且Glc₄与促炎免疫参数关联被治疗消除；在LOPD中总体B细胞频率下降、成熟记忆B细胞与浆母细胞相对增加、TIGIT⁺ CD4⁺ T细胞上升，Tfr-Glc₄关联消退。上述发现表明TLD-MTX通过型别特异的免疫重编程辅助抗rhGAA耐受，为以MTX替代利妥昔单抗的低成本ITI策略提供免疫学依据。