基于转录组信息在霍克希杯菊不同组织及低温胁迫下用于RT-qPCR标准化的内参基因选择与验证

《BMC Plant Biology》：Transcriptome-informed selection and validation of reference genes for RT-qPCR normalization in Cuphea hookeriana across tissues and under low-temperature stress

　　

摘要

背景

逆转录定量PCR（RT-qPCR）被广泛用于定量基因表达，但可靠的标准化需要参考基因在所研究的物种、组织和实验条件下具有稳定的表达。Cuphea hookeriana是一种观赏灌木，其更广泛的景观应用受到耐寒性差的限制。然而，目前尚未有关于该物种RT-qPCR标准化的已验证参考基因的报告。

结果

在本研究中，我们从C. hookeriana叶片转录组中选取了十二个候选参考基因，该转录组在5 °C低温时间序列实验期间生成，并已在NCBI序列读取归档库中以BioProject登录号PRJNA1117973存档。这些候选基因包括延伸因子1α（EF1α）、DnaJ热休克蛋白（DNAJ）、亲环蛋白（CYP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、肌动蛋白（ACT）、18 S核糖体RNA（18 S rRNA）、真核起始因子2（EIF2）、微管蛋白（TUB）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、酰基载体蛋白（ACP）、泛素（UBQ）和泛素结合酶（UBC）。评估了它们在根、茎、叶和花中以及在暴露于5 °C 0、12、24、36和48小时的叶片中的表达稳定性。扩增效率范围为92.41%至104.50%，相关系数为0.992–0.999。geNorm成对变异分析表明，不同组织数据集需要三个参考基因，而低温处理和合并数据集则两个基因已足够。因此，验证分析中对组织样本使用了ACP、UBC和EF1α，对低温处理样本使用了18 S rRNA和EIF2。ΔCq值的单因素方差分析显示，CSLD在不同组织间存在显著差异，MYB11在不同处理时间间存在显著差异。使用最不稳定的单个基因TUB或UBQ进行标准化产生的组依赖性相对表达估计值与使用geNorm推荐组合获得的估计值存在显著差异。

结论

本研究确定了C. hookeriana RT-qPCR分析中特定条件下的参考基因组合。推荐使用ACP、UBC和EF1α的几何平均值进行组织间比较；推荐使用18 S rRNA和EIF2处理5 °C期间采集的样本；推荐使用EIF2和ACT处理包含所有组织和低温处理样本的合并数据集。