基于分生孢子萌发菌丝的水稻稻曲病可重复高效接种体系

《Phytopathology Research》：A reproducible and efficient inoculation system for rice false smut based on conidia-germinated hyphae

　　

摘要
由子囊菌真菌稻绿核菌（Ustilaginoidea virens）引起的水稻稻曲病是水稻最严重的病害之一。传统人工接种方法主要采用分生孢子-菌丝混合物（CH）作为接种体，这往往导致实验结果可重复性差，且不同试验间发病情况变异较大。研究人员建立了一种基于分生孢子萌发菌丝（CGH）的可重复且高效的水稻稻曲病接种体系，即在接种前使分生孢子萌发，从而获得更加均一且具有生理活性的接种体。基于水稻叶片的预培养步骤显著提高了分生孢子的产量和萌发率，与传统的CH相比，CGH在可控条件和田间条件下均表现出更高的侵染效率和更稳定的发病症状。时间进程观察进一步表明，基于CGH的接种能够支持稻绿核菌在水稻颖花中的典型侵染进程。重要的是，该体系能够实现对稻绿核菌突变体的可靠表型鉴定，并有效区分抗病和感病水稻品种。此外，CGH获得的高颖花发病率使得下游分子和多组学分析的样本采集具有一致性。总之，本研究为稻绿核菌-水稻互作体系的功能研究提供了一个优化的接种体系和稳健的平台。

水稻稻曲病是水稻上最具破坏性的病害之一，其病原菌为子囊菌真菌稻绿核菌（Ustilaginoidea virens）。该病菌偏好侵染水稻花器官，在颖壳内扩展并形成稻曲球（FSB），不仅造成严重产量损失，还产生真菌毒素，威胁人和动物健康。然而，自然条件下稻绿核菌的初侵染源尚不明确，田间发病变异极大，难以用于精确的抗性评价和机制研究。因此，可控的人工接种成为研究该病害体系的关键手段。

现有的人工接种方法以分生孢子-菌丝混合物（CH）作为接种体最为常用，但CH中孢子与菌丝生理状态不均一，容易导致侵染不同步，实验可重复性差。此外，传统分生孢子产生效率低、活力参差不齐，进一步限制了接种效果。为克服这些瓶颈，研究人员开发了一种基于分生孢子萌发菌丝（CGH）的接种体系：先将稻绿核菌菌丝块在水稻叶片培养基上预培养以促进产孢，再转至马铃薯蔗糖培养液中培养以增加孢子产量和活力；随后收集分生孢子并在培养液中萌发16小时形成CGH。该体系显著提高了分生孢子产量与萌发率，CGH在温室和田间条件下比传统CH展现出更高的侵染效率和更稳定的发病症状，并支持稻绿核菌在水稻颖花内的典型侵染进程。利用该体系，研究人员成功实现对稻绿核菌突变体的致病力表型鉴定，有效区分抗、感水稻品种，并获得高一致性的病颖花样本，为下游分子和多组学分析提供了可靠材料。该研究成果发表于《Phytopathology Research》。

研究人员在技术方法上采用的关键策略可概括如下：植物材料为水稻品种Pujiang 6（Pu6）、Taipei 309（TP309）、Zhonghua 11（ZH11）和Nipponbare（NPB），均种植于中国三亚田间；供试菌株为稻绿核菌JS60-2和PJ52。采用“水稻叶片培养-马铃薯蔗糖培养液（RL–PSB）”两步产孢策略，获得分生孢子后于PSB中萌发16小时制备CGH；以注射法于孕穗期将接种体注入稻穗。利用碘化丙啶（PI）染色评估孢子活力，立体显微镜观察侵染进程，并通过CRISPR/Cas9介导的同源重组构建基因敲除突变体，RT-qPCR检测水稻防御基因表达。

研究结果部分共包括四个方面。第一，优化接种体制备提高分生孢子质量。通过RL–PSB策略，菌株PJ52和JS60-2的分生孢子产量分别较传统仅PSB培养提高约6.5倍和7.4倍；所得孢子萌发率和活力均显著高于常规方法，且在PSB中培养4–6天收集的孢子萌发率最高，因此选择在PSB中萌发16小时形成CGH用于后续接种。第二，基于CGH的接种支持典型侵染过程。对水稻品种Pu6在孕穗末期接种PJ52的CGH后，4天（dpi）时可见菌丝侵染花丝，6–12天在花器官内增殖，约15天形成稻曲球，该过程与已有CH接种观察结果一致，说明CGH能够真实反映稻绿核菌在颖花中的正常侵染路径。第三，CGH接种体提高侵染效率和可重复性。在温室中，CGH接种Pu6的单穗稻曲球数平均为172个，而CH为57个，且CGH处理的发病一致性显著优于CH；大多数CGH接种稻穗的病颖花率达80%以上，最高达98.4%。浓度梯度试验显示2×10⁵ CGH/mL已足以在感病品种上诱导严重症状。在田间条件下，无论菌株PJ52还是JS60-2，CGH在Pu6、TP309、ZH11和NPB四个水稻背景中均比CH诱导更高数量的稻曲球和更高的病颖花率，尤其在NPB中侵染效率提高约4–6倍。CGH接种还在3 dpi显著诱导更强的水稻病程相关基因表达。第四，基于CGH的接种适用于功能与抗性分析。利用CRISPR/Cas9技术获得PJ52背景的Δscre9、ΔUvpmk1和ΔUvpsr1三个突变体，CGH接种显示Δscre9稻曲球数显著减少，ΔUvpmk1不能形成稻曲球且不能定殖颖花内部组织，ΔUvpsr1虽能侵入颖花内部但不能形成稻曲球，与既往研究一致。CGH接种还准确区分了抗病品种IR28和感病品种Pu6，表明该体系可用于水稻抗性评价。此外，CGH达到近乎完全的病颖花率，提高了下游组学样本采集的一致性和准确性。

讨论部分指出，CGH体系的优势在于：通过孢子萌发形成均一且生理活跃的接种单元，缩短接种后延迟期，促进同步侵染；同时只有具有萌发能力的活力孢子才能形成CGH，从而富集具侵染能力的繁殖体。RL–PSB策略不仅提高孢子活性，也大幅提升产孢效率，且水稻叶片培养基可重复利用，节省时间。虽然CGH注射接种仍不能完全模拟自然侵染途径，但CGH可能适用于喷雾等非侵入性接种方法，值得未来研究优化。研究结论可总结为：本研究开发了基于分生孢子萌发菌丝（CGH）的接种体系，通过优化接种体制备步骤（加入水稻叶片预培养）提高了分生孢子活力和接种体均一性，克服了传统CH混合物的主要缺陷。CGH接种体支持典型侵染进程，同时具有更高的侵染效率和更稳定的发病结果，为稻绿核菌突变体表型鉴定、水稻抗性评估，以及下游分子和多组学分析提供了可靠平台。