机器学习识别ac4C相关预后特征及TUBA1C作为COAD的治疗靶点

《Mammalian Genome》：Machine learning identifies ac4C-related prognostic signature and TUBA1C as therapeutic target in COAD

　　

摘要：为探索N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine，ac4C）相关基因（acRGs）在结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）中的作用，并鉴定可靠的预后生物标志物和潜在治疗靶点，研究人员分析了多源转录组数据集（TCGA-COAD、GSE39582、GSE17536）和单细胞RNA测序数据。整合十种机器学习算法构建了基于acRG的预后特征（acRG-based prognostic signature，acRGBS）。进行了免疫微环境（tumor microenvironment，TME）和基因组谱分析，并通过体外功能实验验证TUBA1C的作用。acRGBS包含四个核心基因（SARAF、CDC42SE2、TSPYL2、TUBA1C），能有效将COAD患者分为具有不同生存结局的高风险组和低风险组，且是独立预后因素。高风险患者表现出基因组不稳定性增加和免疫抑制性TME，而低风险患者则具有良好的免疫治疗反应。TUBA1C在COAD细胞中过表达，敲低可抑制增殖/迁移并诱导凋亡。acRGBS是COAD稳健的预后工具，TUBA1C可作为候选治疗靶点，为COAD个体化管理提供新见解。

本研究以结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）为对象，系统探讨了N4-乙酰胞苷（N4-acetylcytidine，ac4C）相关基因（acRGs）在肿瘤预后和免疫微环境中的作用。ac4C是一种由乙酰转移酶NAT10催化的保守RNA修饰，在多种肿瘤中参与调控细胞增殖、转移和凋亡。然而，ac4C相关转录程序在COAD中的临床意义及其与肿瘤微环境和基因组特征的关系尚不完全清楚。基于此，研究人员整合多源转录组数据、单细胞RNA测序数据和机器学习算法，旨在构建可靠的预后特征并筛选潜在治疗靶点。

研究人员利用TCGA-COAD、GSE39582和GSE17536三个独立队列的转录组数据，以及GSE132465单细胞RNA测序数据集，通过无监督聚类、细胞类型注释、差异表达分析、细胞间通讯分析和功能富集分析，系统描绘了COAD的转录组图谱。研究首先采用Harmony算法校正批次效应，鉴定出23个细胞簇并归类为8种主要细胞谱系；随后基于2135个ac4C相关基因计算单细胞acRG活性评分，发现上皮细胞中acRG活性显著高于其他谱系，且acRG高活性细胞中细胞-细胞黏附相关生物学过程显著富集。利用差异表达基因，研究人员整合十种机器学习算法（包括随机生存森林、弹性网络、Lasso、Ridge、逐步Cox、CoxBoost、plsRcox、SuperPC、GBM和生存支持向量机）的88种组合，在留一交叉验证框架下筛选出四个与总生存期（overall survival，OS）相关的核心基因：SARAF、CDC42SE2、TSPYL2和TUBA1C，并构建了acRG-based prognostic signature（acRGBS）。通过Kaplan-Meier生存分析、时间依赖性受试者工作特征（ROC）曲线、单因素和多因素Cox回归分析，研究验证了acRGBS在三个队列中均能有效将患者分为高低风险组，且为独立预后因素。此外，研究人员分析了高低风险组的体细胞突变谱和拷贝数变异（copy number variations，CNVs），并利用CIBERSORT、ssGSEA、TIDE和免疫表型评分（immunophenoscore，IPS）评估免疫微环境特征。体外实验中，研究人员在正常结肠黏膜上皮细胞系NCM-460和COAD细胞系HCT116、HT29中通过小干扰RNA敲低或过表达TUBA1C，结合CCK-8实验、克隆形成实验、EdU掺入实验、Transwell迁移/侵袭实验和流式细胞术凋亡检测，验证了TUBA1C的功能。

研究结果部分包括以下几个关键发现。第一，在“COAD的转录组图谱”部分，研究人员通过单细胞RNA测序分析鉴定出8种主要细胞类型，并在肿瘤与正常组织间观察到细胞比例差异。第二，在“acRG活性评分表现出显著差异”部分，上皮细胞表现出显著更高的acRG评分，其中超过90%的上皮细胞属于acRG高活性亚组；细胞间通讯分析显示acRG高活性组与其他细胞类型的相互作用更频繁、更强，且差异表达基因富集于细胞-细胞黏附相关通路。第三，在“基于acRG的COAD预后特征构建”部分，通过十种机器学习算法整合，Lasso回归和随机生存森林组合模型最终筛选出SARAF、CDC42SE2、TSPYL2和TUBA1C四个核心基因；SHAP分析显示TUBA1C对风险分层贡献最大。第四，在“基于acRG的COAD预后特征验证”部分，ROC曲线证实acRGBS在1、3、5年时间点均具有良好预测效能；单因素和多因素Cox回归分析显示acRGBS风险评分是独立预后因素（单因素HR=1.77，多因素HR=1.81）；亚组分析表明高风险组与TNM晚期和微卫星不稳定相关。第五，在“与基于acRG的COAD预后特征相关的基因组特征”部分，高风险组APC、TP53、TTN突变率更高，且CNV更广泛。第六，在“与基于acRG的COAD预后特征相关的免疫微环境”部分，高风险组具有更高的II型干扰素反应、免疫检查点表达和促炎活性评分，同时TIDE评分、免疫排斥和免疫功能障碍评分也更高，而低风险组IPS值更高，预测对免疫检查点抑制剂更敏感。第七，在“COAD中四核心基因acRG预后特征的验证”部分，单细胞和空间转录组数据表明TUBA1C在恶性细胞中富集表达，且与acRG评分显著正相关。第八，在“TUBA1C作为COAD候选治疗靶点”部分，体外实验证实TUBA1C敲低抑制HCT116和HT29细胞增殖、迁移和侵袭并诱导凋亡，而过表达则促进增殖并抑制凋亡。

讨论部分指出，acRGBS在多个独立队列中表现出稳健的预后分层能力，其与基因组不稳定性和免疫抑制微环境的相关性为理解ac4C修饰在COAD中的作用提供了新视角。研究人员强调，高acRG组既有IFN-γ信号增强又有T细胞功能障碍评分升高，可能代表一种“炎症但免疫抑制”的状态。研究还讨论了NAT10介导的ac4C修饰在多种肿瘤中调控免疫逃逸的机制，与本研究中高风险组的免疫特征一致。此外，TUBA1C被鉴定为ac4C相关预后框架中的核心基因，并具有癌基因功能，但尚需直接证据证明其受ac4C修饰调控。研究结论部分强调，该研究系统描绘了COAD中ac4C修饰的景观，建立了包含四个核心基因的acRGBS，该特征能有效进行风险分层并预测免疫治疗反应，同时TUBA1C被验证为COAD的关键致癌驱动因子和候选治疗靶点，为改善COAD风险分层和精准医学策略提供了基础。