7-酮胆固醇诱导的氧化应激会损害胰腺β细胞中的胰岛素分泌

《Acta Diabetologica》：7-Ketocholesterol-induced oxidative stress impairs insulin secretion in pancreatic β-cells

　　**摘要**
**目的**
葡萄糖脂毒作用引起的β细胞功能障碍是2型糖尿病（T2D）发病机制的关键因素。虽然已知胆固醇会加剧这种功能障碍，但其主要氧化产物7-酮胆固醇的具体作用仍不明确。
**方法**
我们使用UPLC-MS方法对包括T2D患者和正常葡萄糖耐量（NGT）个体在内的队列中的血清7-酮胆固醇水平进行了定量分析。利用INS-1细胞和原代胰岛，研究了7-酮胆固醇对β细胞功能（包括葡萄糖刺激的胰岛素分泌[GSIS]、灌流和钙动态）的影响，以及与氧化应激（活性氧[ROS]、线粒体膜电位[MMP]、ATP）和基因/蛋白质表达相关的机制。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）被用于修复观察到的功能障碍。
**结果**
队列分析显示，T2D患者的血清7-酮胆固醇水平显著高于NGT对照组（0.070 ± 0.035 vs. 0.051 ± 0.021 μmol/L），且这种升高与早期胰岛素分泌呈负相关。在INS-1细胞和原代胰岛中，7-酮胆固醇暴露会损害GSIS并破坏细胞内钙信号传导。此外，7-酮胆固醇诱导了明显的氧化应激，表现为ROS产生增加、MMP丢失和ATP水平下降。从机制上看，7-酮胆固醇促进了NRF2向核内的转运，并上调了抗氧化基因（包括Gpx4和Sod1）的表达。关键的是，NAC联合使用可减轻7-酮胆固醇引起的氧化应激，并恢复胰岛素分泌和钙信号传导。
**结论**
我们的发现表明，7-酮胆固醇水平升高与T2D患者的β细胞功能障碍相关，并似乎通过诱导胰腺β细胞中的氧化应激来损害胰岛素分泌，从而将7-酮胆固醇确定为糖尿病进展的潜在因素。

**引言**
由脂质和葡萄糖脂毒作用引起的胰腺β细胞功能障碍可能促进了2型糖尿病的发病机制[1]。游离脂肪酸（FFAs）是胰岛素分泌的重要代谢耦合因子，其长期过量会对β细胞功能产生不利影响，但其潜在机制尚未完全明确[2, 3]。胆固醇作为细胞膜的一部分，影响膜流动性并调节多种细胞功能[2]，胆固醇代谢紊乱会抑制葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）[4]。胆固醇可转化为氧甾醇，而氧甾醇通常比胆固醇本身更具毒性，会加速疾病进展[5]。7-酮胆固醇是一种关键的生物活性氧甾醇，参与了多种疾病的发病机制，包括动脉粥样硬化、心血管疾病、阿尔茨海默病和年龄相关性黄斑变性[6, 7, 8, 9]。Chang等人的研究表明，即使少量饮食中的7-酮胆固醇也会加重肥胖小鼠的肝脂肪变性和炎症[10]。尽管如此，7-酮胆固醇对胰腺β细胞功能的直接影响尚未得到广泛报道。
在胰腺β细胞中，抗氧化酶的表达较低，使得这些细胞特别容易受到氧化应激的影响[11]。NRF2（核因子红细胞2（NF-E2）相关因子2）在减轻氧化应激中起着重要作用。研究表明，在棕榈酸-胎球蛋白A处理的MIN6细胞中，NRF2表现出高表达和核内转运。抑制NRF2会导致脂肪生成基因的表达、脂滴的消失、凋亡细胞数量减少以及胰岛素分泌的恢复[12]。
基于上述背景，我们的目的是确定7-酮胆固醇是否影响胰腺β细胞功能障碍，并阐明其潜在机制。我们的结果提示，7-酮胆固醇与胰岛素分泌功能障碍相关，可能是通过调节氧化应激来实现的。

**材料**
主要试剂包括：胶原酶V（Sigma，C9263）、7-酮胆固醇（Sigma，C2394）、Histopaque?-1077（Sigma）、N-乙酰-L-半胱氨酸（Beyotime）和细胞培养试剂（ThermoFisher）。检测试剂盒来自YEASEN（CCK-8）和FUDE生物技术（BCA）。C57BL/6小鼠由GemPharmatech有限公司提供。7-酮胆固醇溶解在乙醇中并按描述方法稀释[13]。

**患者数据和血清样本收集**
患者数据和血清样本来自中国浙江省杭州市40–65岁社区代谢综合征患病率的调查。所有参与者都接受了口服葡萄糖耐量测试（OGTT）和人体测量评估。鉴于这项生物标志物研究的探索性质，采用了有针对性的抽样策略以优化血清7-酮胆固醇（7KC）组间差异的检测。并非随机选择，而是严格根据1999年WHO的糖尿病诊断标准对个体进行分类。为了最大化代谢对比，我们优先招募了葡萄糖耐量正常（NGT）和血糖参数显著升高的个体（2型糖尿病）。最终，选择了92份血清样本（29份来自2型糖尿病患者，63份来自NGT对照组）进行7-酮胆固醇水平的定量分析。该研究获得了Sir Run Run Shaw医院伦理委员会的批准，并从所有参与者处获得了书面知情同意。

**超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）**
用于血清7-酮胆固醇定量分析的UPLC-MS/MS方法改编自McDonald等人建立的经过充分验证的方案[14]。对提取效率进行了轻微调整以适应我们的特定队列样本。简要来说，解冻后，血清被转移到含有1.4 mL甲醇/二氯甲烷和BHT抗氧化剂的离心管中，加入7-酮胆固醇-d7（5 μg/mL）作为内标和100 μL 2 mol/L NaOH的甲醇溶液，然后进行涡旋混合。皂化、离心和相分离后，下层提取物小心转移到新管中并用氮气干燥。提取物随后用200 μL 90%甲醇复溶，通过UPLC-Q-trap 5500 MS系统（Waters Corporation，美国）进行后续分析。该方法在1-1000 ng/mL范围内表现出良好的线性（r2 ≥ 0.999）， LOD为0.3 ng/mL，LOQ为1 ng/mL。回收率在92.41%到99%之间，精密度可接受（日内RSD = 1.00%；日间RSD = 14.36%）。完整的验证细节见补充表S1。

**胰岛解剖**
所有动物实验均获得了浙江中医药大学动物伦理与福利委员会（批准号IACUC-202210-29）的批准。30只雄性C57BL/6小鼠（12周龄，平均体重26.83 ± 1.30 g）被麻醉，十二指肠被结扎，胰腺通过共同胆管灌注1 mg/mL胶原酶V并在37°C下消化28分钟。消化结束后加入含有10% FBS的HBSS缓冲液终止。过滤和离心后，使用Histopaque-1077密度梯度纯化胰岛。最后，在显微镜下手工挑选胰岛。胰岛纯度通过二硫苏糖醇（DTZ）染色评估，而胰岛活力则使用Calcein AM/PI活/死染色试剂盒进行定量评估，并通过共聚焦显微镜成像。

**INS-1细胞和胰岛的细胞活力测定**
INS-1细胞和分离的小鼠胰岛用指定浓度的7-酮胆固醇处理24小时，然后用CCK-8试剂盒评估细胞活力。

**INS-1细胞和胰岛的GSIS**
实验按照先前描述的方法进行[4]。INS-1细胞先用7-酮胆固醇处理24小时，然后饥饿30分钟，再用2.8 mmol/L或25 mmol/L葡萄糖刺激1小时。使用胰岛素免疫测定试剂盒（RT300，Ezaasy）测量上清液中的胰岛素水平，并将其归一化到细胞蛋白含量。

**胰岛灌流**
饥饿30分钟后，胰岛置于37°C的灌流装置中的腔室中[15]。达到平衡后，依次灌流不同的液体缓冲液（2.8 mmol/L葡萄糖、16.8 mmol/L葡萄糖、2.8 mmol/L葡萄糖和30 mmol/L KCl），每分钟收集一份样本。胰岛素含量按上述方法测量，并将其归一化到2.8 mmol/L葡萄糖缓冲液中的平均基线胰岛素分泌水平。

**胰岛的钙成像**
胰岛在2 mmol/L葡萄糖中与fluo-4-AM（Invitrogen）孵育45分钟，洗涤后继续孵育15分钟。随后，在16.8 mmol/L葡萄糖刺激下转移到激光共聚焦显微镜（Zeiss，德国）上进行成像。钙成像的检测和图像测量每10秒进行一次（激发/发射：488/515 nm）。结果按2 mmol/L葡萄糖的基线水平进行归一化。

**INS-1细胞中的ROS、MMP和ATP测定**
ROS用荧光探针DCFH-DA定量。MMP用JC-1染色评估。ATP水平用商业试剂盒（Beyotime，中国）测定，并归一化到总蛋白。完整的实验方案见补充信息。

**INS-1细胞中的免疫荧光**
实验按照先前描述的方法进行[4]。处理后，INS-1细胞爬片用4%甲醛固定15分钟，再用0.3% Triton X-100渗透10分钟。室温下用5% BSA封闭1小时后，在4°C下用抗NRF2一抗（bs-1074R，Bioss；1:200）孵育过夜，然后在黑暗中用荧光二抗（A-11037，ThermoFisher Scientific；1:200）孵育90分钟。核用DAPI染色，图像通过共聚焦显微镜捕获。

**INS-1细胞中的qRT-PCR**
总RNA使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）从培养细胞中提取，然后在Roche 480系统上进行定量PCR。基因表达通过2^-ΔΔCt方法计算。引物序列见补充信息。

**INS-1细胞中的Western blot**
电泳和转移到PVDF膜后，膜在4°C下与一抗孵育过夜，然后与HRP结合的二抗（1:1000；ABclonal）孵育1小时。蛋白条带用增强化学发光法检测。抗体的详细信息见补充信息。

**统计分析**
数据以平均值±SD表示，除了钙成像以代表性实验的平均值±SD表示。两组之间的差异通过Student’s t-test进行评估。对于多个组，使用GraphPad Prism 7进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。

**结果**
T2D患者的血清7-酮胆固醇水平显著升高，并与早期胰岛素分泌呈负相关。T2D患者的空腹血糖、30分钟血糖、120分钟血糖、HbA1c、三酰甘油和HOMA-IR水平高于正常葡萄糖耐量受试者（表S2）。两组之间的总胆固醇、LDL-C和HDL-C水平没有差异（表S2）。T2D患者的30分钟胰岛素、HOMA-beta和早期胰岛素分泌指数（△I30/△G30）水平低于正常葡萄糖耐量受试者（表S3）。队列分析显示，T2D患者的7-酮胆固醇水平显著高于正常葡萄糖耐量受试者（0.070 ± 0.035 vs. 0.051 ± 0.021 μmol/L，P < 0.01）（图1A），7-酮胆固醇与早期胰岛素分泌指数呈负相关，皮尔逊相关系数为-0.216（P < 0.05）（图1B）。为了排除脂质调节治疗的潜在混杂效应，我们系统回顾了参与者的用药史，并排除了服用他汀类药物和贝特类药物（已知会对脂质代谢产生显著影响的药物）的参与者。结果表明，即使在未接受降脂治疗的人群中，T2D患者的血清7-酮胆固醇水平也显著高于NGT对照组（n = 26 vs. 62，0.068 ± 0.034 vs. 0.050 ± 0.021 μmol/L，P < 0.01）（图1C）。这项研究发现证实，7-酮胆固醇的升高并非由降脂药物引起，并且其浓度与早期胰岛素分泌呈负相关，这表明7-酮胆固醇可能参与了β细胞功能障碍的发病机制。图1展示了NGT（正常葡萄糖耐量）和T2D（2型糖尿病）患者血清中7-酮胆固醇的水平以及皮尔逊系数分析结果：(a) T2D患者的7-酮胆固醇水平显著高于NGT患者（0.070±0.035对比0.051±0.021 μmol/L；NGT=63，T2D=29；P<0.01）；(b) 7-酮胆固醇水平与早期胰岛素分泌指数显著负相关（r = -0.216，P<0.05）；(c) 在排除了使用降脂药物的患者后，T2D患者的7-酮胆固醇水平仍然显著高于NGT患者（NGT=62；T2D=26；P<0.05）。这些发现进一步表明，7-酮胆固醇可能在2型糖尿病的病理发展中起着重要作用。

7-酮胆固醇处理对胰腺β细胞胰岛素分泌功能的影响：为了评估胰腺β细胞的活力，将INS-1细胞暴露于不同浓度的7-酮胆固醇中24小时。结果显示，25 μmol/L的7-酮胆固醇并未显著影响INS-1细胞的活力，同样50 μmol/L的7-酮胆固醇也未对原始胰岛产生不良影响（图2A-B）。对分离出的胰岛进行纯度检测（DTZ染色显示纯度超过90%）和活力检测（Calcein AM/PI试验显示活力为92.97%），验证了实验模型的可行性，相关图像见补充图S1。随后，在两种模型中进行了葡萄糖刺激胰岛素释放试验（GSIS），结果显示25 μmol/L 7-酮胆固醇处理显著降低了INS-1细胞的胰岛素分泌（P<0.05），50 μmol/L 7-酮胆固醇处理的原始胰岛也显示类似的趋势（P<0.05，图2C-D）。此外，在原始胰岛的动态灌流实验中，7-酮胆固醇处理显著降低了胰岛素分泌，表现为曲线下面积（AUC）的减少（P<0.001，图2E-F）。基因表达分析显示，7-酮胆固醇处理后，与β细胞成熟和胰岛素分泌调节相关的转录因子（如Pdx1和Nkx6.1）发生了变化（图3B），同时观察到GLUT2基因和蛋白表达下调（图3C-D）。功能钙成像也表明，7-酮胆固醇在高葡萄糖刺激下显著降低了胰岛内钙离子的荧光强度（图3E），这表明7-酮胆固醇通过减少胰岛素分泌颗粒释放所需的钙离子可用性来损害胰岛素分泌。

此外，研究还发现了7-酮胆固醇对β细胞氧化应激和线粒体功能的影响：许多研究表明，线粒体功能障碍和氧化应激对β细胞功能至关重要。在INS-1细胞中处理25 μmol/L 7-酮胆固醇后，观察到细胞内ROS水平显著升高（P<0.05），MMP和ATP水平均下降（图4A-C）。氧化应激发生时，β细胞中的抗氧化通路被激活，NRF2从细胞质转移到细胞核。结果指出，7-酮胆固醇处理后Gpx4、Sod1、Txnip、Nqo1、Ho1和Cox4等基因或蛋白的表达发生改变（图4D-G）。NAC能够缓解7-酮胆固醇诱导的氧化应激和线粒体功能障碍：实验表明NAC部分恢复了胰岛素分泌功能，降低了胰岛素分泌相关蛋白的表达，并显著减少了细胞内ROS水平（图5F-J）。通过NAC处理，NRF2的核转位得到改善，从而缓解了氧化应激。

综上所述，这项研究揭示了7-酮胆固醇通过多种机制损害β细胞功能，包括氧化应激、线粒体功能障碍以及胰岛素分泌相关蛋白的表达变化。这些发现强调了7-酮胆固醇在2型糖尿病发病机制中的潜在作用，为开发保护β细胞功能的治疗策略提供了基础。然而，鉴于β细胞病理生理学的复杂性，未来需要进一步研究其他可能的机制以全面理解其致病机制。