RS1特异性ACMG/AMP变异分类标准的制定及试点变异解读

《Human Genetics》：Development of RS1-specific ACMG/AMP variant classification criteria with pilot variant curation

　　

摘要
针对视网膜疾病的基因治疗正在研发中，包括RS1相关X连锁视网膜劈裂症。因此，在纳入患者时，确定哪些变异具有致病性、哪些为良性至关重要。临床基因组资源（ClinGen）X连锁遗传性视网膜疾病（XLRD）变异策展专家小组（VCEP）汇集了临床科学家、分子生物学家和遗传学家，运用其专业知识，审查变异相关的临床、遗传、群体和功能证据。美国医学遗传学与基因组学学院（ACMG）指南已针对RS1进行修改，以制定一套高度系统化且保守的变异评估框架。策展过程涉及应用28种不同的代码，每种代码具有4个强度等级（非常强、强、中等、支持性），涵盖表型、群体数据、计算评估、功能影响和共分离等不同领域。利用RS1特异性规则，共测试了54个试点变异，其中包括ClinVar中的47个变异。其中21个变异被重新分类：2个可能致病性变异和1个可能良性变异被改为意义未明变异，4个先前未分类的变异被改为致病性、可能致病性和可能良性。其他变化解决了冲突或多个分类并存的问题。

论文解读

**研究背景与目的**
X连锁视网膜劈裂症（XLRS）是由RS1基因半合子变异引起的一种X连锁视网膜内层营养不良性疾病，男性患者在生命早期即出现视力下降、负波型视网膜电图及特征性的黄斑车轮状外观。RS1基因编码视锥蛋白（retinoschisin），一种由225个氨基酸组成的分泌性蛋白，通过半胱氨酸残基间的二硫键形成同源八聚体环结构，主要发挥细胞黏附功能。致病性变异多为位于盘状结构域（discoidin domain）的错义变异，但截短和剪接变异亦有报道。随着针对RS1基因的基因治疗进入1/2期临床试验，准确判定变异致病性对患者筛选至关重要。然而，不同实验室和数据库对同一变异的分类常存在分歧，缺乏统一的基因特异性解读标准。为此，临床基因组资源（ClinGen）下属的X连锁视网膜营养不良变异策展专家小组（XLRD VCEP）基于美国医学遗传学与基因组学学院（ACMG）和分子病理学协会（AMP）指南，针对RS1基因制定了一套系统化、保守且可重复的变异分类规则，并开展试点变异解读以验证其有效性和实用性。

**研究技术与方法**
研究人员采用多领域证据整合策略，对ACMG/AMP指南中的28个代码逐一评估，结合计算预测、功能实验、群体频率、表型及家系共分离等证据。计算预测采用REVEL和SpliceAI工具，并比较了11种计算机预测工具在RS1变异上的效能。群体频率数据来源于gnomAD v4.1.0，功能证据来自细胞实验和基因敲入/敲除小鼠模型等已发表文献。试点变异名单包括ClinVar中47个变异和文献中7个变异，由专家策展人系统性解读，经VCEP线上会议讨论和批准。所有变异命名遵循人类基因组变异学会（HGVS）指南，以GRCh38为参考基因组。

**研究结果**
**基因特异性代码的制定**
通过对28个ACMG/AMP代码逐一审议，6个代码直接沿用，10个代码不适用于RS1，12个代码经RS1特异性修改后采用。引入基于积分的组合系统，将各代码按证据强度赋值（无证据0分、支持性±1、中等±2、强±4、非常强±8），总积分≥10判定为致病性（P），6–9分为可能致病（LP），0–5分为意义未明（VUS），-1至-6分为可能良性（LB），≤-7分为良性（B）。

**PVS1决策树与剪接规则**
针对截短变异和剪接变异，建立了详细的PVS1决策树。起始密码子变异因无替代起始密码子且后续框内甲硫氨酸位于第5外显子，PVS1等级由中等提升至非常强。外显子图谱明确了各剪接位点和关键功能域，指导剪接变异的PVS1赋值。

**计算与功能证据优化**
研究验证REVEL是预测RS1错义变异致病性的最佳工具之一，并依据ClinGen序列变异解读（SVI）工作组建议设定阈值。功能研究确定7个关键半胱氨酸残基（p.Cys40、p.Cys59、p.Cys63、p.Cys110、p.Cys142、p.Cys219和p.Cys223）参与二硫键形成，为蛋白质折叠和八聚体组装所必需，这些位点的变异可赋予PM1_strong证据。此外，5个参与亚基间盐桥形成的残基（p.Glu72、p.Trp122、p.Trp163、p.Arg200和p.Glu215）经群体数据库验证缺乏良性变异，符合PM1标准。功能实验表明，分泌缺陷是常见致病机制，敲除/敲入小鼠模型给予PS3_strong，细胞实验给予PS3_supporting。终止密码子缺失变异导致蛋白C端增加42个氨基酸（长度增加19%），并引入额外半胱氨酸，破坏蛋白构象，故PM4升级为PM4_strong。

**群体数据阈值调整**
初始PM2、BA1、BS1阈值来自一般基因的建议，但分析gnomAD v4.1.0时发现部分已知致病/可能致病变异在多个半合子个体中出现，因此调整阈值：PM2_supporting要求变异在gnomAD中不存在、或半合子中不存在、或半合子等位基因频率<2.0×10^-6；BA1阈值设为≥2×10^-4；BS1阈值设为≥2×10^-5。

**临床证据与表型定义**
为避免误纳入非典型病例，XLRD VCEP定义了具有高度特异性表型需满足的条件：男性患者13岁前发病，存在功能性视力损害和黄斑区劈裂，视网膜脱离不计入特异性表型。PS4代码按受累先证者数量分级（≥9个为非常强，5–8个为强，3–4个为中等，2个为支持性）。PP1共分离代码依据减数分裂次数分级（≥3次减数分裂为强，2次为中等，1次为支持性）。PS2/PM6新生变异代码采用计分制，确认母亲身份的确认新生计2分，假设计1分。

**试点变异解读结果**
应用RS1特异性规则对54个变异进行解读，其中47个来自ClinVar。结果21个变异分类发生改变：2个LP改为VUS，1个LB改为VUS，4个无分类变异改为P（2个）、LP（1个）和LB（1个）；2个存在冲突分类的变异分别统一为VUS和LB；5个混合分类（如P/LP、B/LB）被整合为单一分类；7个变异在P与LP或B与LB之间调整。其余26个变异维持原分类。另对7个非ClinVar变异进行分类，结果4个P、2个LP、1个VUS。示例解读展示了c.78+5G>A（LP）和c.35T>A（p.Leu12His）（VUS）的详细证据组合过程。

**讨论与结论**
基因特异性变异解读指南能够提高分类的准确性和一致性。针对X连锁基因，半合子等位基因频率是更合适的群体证据来源，但某些已知致病变异在半合子个体中仍有检出，提示需谨慎设定阈值。部分出版物缺乏详细的临床表型和家系数据，限制了PS4和PP1等代码的使用，研究人员呼吁同行发表更完整的临床信息。此外，gnomAD v4.0包含英国生物库样本，可能纳入未排除特定表型的个体，导致致病或可能致病变异在“健康”对照中出现频率上升，提醒设置频率阈值时需考虑该偏倚。通过本次试点，RS1特异性指南被证明易于应用且能提供较可靠的致病性预测。最终，这些规则已提交ClinGen批准，并获美国食品药品监督管理局（FDA）认可，为XLRS基因治疗的临床试验患者筛选提供了重要的分类依据。