SIX1通过重编程糖酵解代谢并损害CD8+ T细胞效应功能驱动急性髓系白血病进展

《Immunologic Research》：SIX1 drives acute myeloid leukemia progression by reprogramming glycolytic metabolism and impairing CD8? T-cell effector function

　　

本研究旨在探讨同源盒基因SIX1（sine oculis homeobox homolog 1，SIX1）在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）进展中的作用，并探索其潜在的代谢和免疫机制。研究人员采用逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测了人骨髓基质细胞（HS-5）和AML细胞系（HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4和MOLM13）中SIX1的表达。通过RNA干扰和质粒转染分别构建了SIX1敲低和SIX1过表达的MOLM13细胞。利用流式细胞术、EdU掺入、MTT法和酶联免疫吸附测定（ELISA）评估了细胞周期分布、增殖以及代谢参数，包括细胞内葡萄糖、乳酸和三磷酸腺苷（ATP）水平。通过透射电子显微镜分析了线粒体含量。在低糖条件下，将来自健康供者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）与基因修饰的MOLM13细胞共培养，以评估T细胞比例和细胞因子（IL-6、TNF-α和IFN-γ）产生。进一步建立AML小鼠模型，通过流式细胞术评估SIX1对T细胞组成和功能的影响，同时应用整体代谢组学表征体内代谢重编程。SIX1在AML细胞中显著上调，并通过增强糖酵解代谢促进MOLM13细胞增殖。此外，SIX1在体外和体内均抑制CD8⁺ T细胞效应功能，并与AML小鼠中氨基酸、葡萄糖和脂质代谢的广泛改变相关。SIX1通过促进白血病细胞中的糖酵解重编程并可能通过代谢竞争损害CD8⁺ T细胞效应功能，从而促进AML进展，这表明SIX1是一个有前景的治疗靶点。

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种起源于骨髓的侵袭性血液恶性肿瘤，以造血祖细胞分化阻滞及其在外周血、骨髓和髓外组织中的异常蓄积为特征，约占成人白血病病例的80%，5年相对生存率仅约32%。近年研究表明，AML进展不仅受白血病细胞内在遗传和表观遗传改变驱动，还受肿瘤免疫微环境的重要影响。代谢重编程是恶性肿瘤的标志之一，白血病细胞增强糖酵解并改变营养利用，在支持自身快速增殖的同时，通过营养竞争和代谢产物积累损害CD8⁺ T细胞的活化与效应功能，从而促进免疫逃逸和疾病进展。然而，协调AML细胞代谢重塑及其对抗肿瘤免疫影响的转录机制仍不完全清楚。同源盒基因SIX1（sine oculis homeobox homolog 1, SIX1）是一种高度保守的转录因子，在多种实体瘤中异常高表达并促进肿瘤发生发展，但SIX1在AML中的功能意义及是否通过糖代谢重编程间接调节抗白血病免疫反应尚缺乏研究。为此，研究人员首次从免疫代谢角度探讨了SIX1在AML进展中的作用，该研究发表于《Immunologic Research》。

研究人员首先在AML细胞系中检测了SIX1表达，并构建了SIX1敲低和过表达的MOLM13细胞，通过一系列功能实验评估其对增殖、细胞周期和糖代谢的影响；随后利用健康供者外周血单个核细胞与基因修饰的MOLM13细胞在低糖条件下共培养，分析T细胞亚群比例和细胞因子产生；进一步建立AML小鼠模型，在体内验证SIX1对CD8⁺ T细胞效应功能的影响，并通过整体代谢组学分析血清代谢物变化。主要技术方法包括：逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）、慢病毒介导的RNA干扰和过表达、CCK-8增殖实验、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）掺入实验、流式细胞术、酶联免疫吸附测定（ELISA）、透射电子显微镜和液相色谱-质谱联用（LC-MS）非靶向代谢组学。细胞来源包括人AML细胞系（MOLM13、THP-1、NB4、KG-1、SKM-1、HL-60，购自上海宏顺生物科技有限公司）、人骨髓基质细胞HS-5，以及健康供者PBMCs；体内实验使用C57BL/6小鼠和鼠源C1498细胞。

结果部分，第一，SIX1调节急性髓系白血病细胞的增殖能力。通过qPCR和Western blot验证了SIX1在AML细胞系中显著高表达，且MOLM13细胞中最高。在MOLM13和THP-1细胞中，SIX1过表达增加G1/S期转换、提高EdU阳性率和CCK-8增殖活性，而SIX1敲低则诱导G1期阻滞并降低增殖，表明SIX1正性调节AML细胞增殖。

第二，SIX1影响急性髓系白血病细胞的葡萄糖利用。ELISA检测显示，SIX1过表达增加细胞内ATP、乳酸和葡萄糖含量，敲低则降低这些代谢物水平；透射电镜显示SIX1过表达增加线粒体数量，敲低减少线粒体数量。这些结果提示SIX1通过增强糖酵解活性促进AML细胞增殖。

第三，SIX1抑制CD8⁺ T细胞功能。在低糖条件下，将不同SIX1表达的MOLM13细胞与PBMCs共培养后，流式细胞术检测发现，SIX1过表达显著降低CD3⁺CD4⁺ T细胞、CD3⁺CD8⁺ T细胞和CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞比例，并增加CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺ T细胞比例；敲低则相反。同时，ELISA和qPCR显示SIX1过表达降低IFN-γ水平，升高IL-6和TNF-α水平，而敲低则逆转这些变化。

第四，体内验证SIX1抑制CD8⁺ T细胞效应功能。在AML小鼠模型中，与对照组相比，SIX1过表达组外周血CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和CD8⁺IFN-γ⁺ T细胞比例显著降低，调节性T细胞（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）比例显著增加；敲低组则相反，进一步证实SIX1在体内负性调节T细胞浸润和效应功能。

第五，通过体内实验研究SIX1对AML小鼠代谢的调节作用。对小鼠血清进行整体LC-MS代谢组学分析，主成分分析显示对照组与SIX1过表达/敲低组间代谢谱明显分离。差异代谢物筛选显示，SIX1过表达组与对照组相比有526个下调、155个上调代谢物；敲低组与对照组相比有393个下调、405个上调代谢物；取交集得到78个共同差异代谢物。KEGG通路富集分析显示，差异代谢物主要富集于氨基酸代谢和糖/脂代谢，并在SIX1过表达与敲低组间比较中主要富集于氨基酸代谢和谷胱甘肽代谢，表明SIX1可诱导AML小鼠体内代谢重编程。

讨论部分，研究人员指出，SIX1在实体瘤中具有促增殖作用，本研究首次直接证实其在AML中正性调节细胞增殖。SIX1通过增加葡萄糖、ATP和乳酸水平增强糖酵解，与“Warburg效应”一致。代谢组学还显示SIX1广泛改变氨基酸和脂质代谢，尤其是谷氨酰胺、精氨酸和色氨酸等对CD8⁺ T细胞功能重要的氨基酸，以及长链脂肪酸和磷脂，可能通过营养竞争和代谢产物积累抑制CD8⁺ T细胞效应功能，同时为白血病细胞提供生物合成原料和氧化应激保护。该研究还发现SIX1过表达导致CD8⁺ T细胞丰度和效应活性降低，而敲低则增强，与体外结果一致。研究局限性包括未直接检测CD8⁺ T细胞的葡萄糖摄取和代谢活性、未观察T细胞代谢通路的动态变化、体内模型不能完全模拟人免疫微环境，以及未进行回补实验以确证SIX1对CD8⁺ T细胞功能的影响完全通过代谢调节介导。结论部分翻译：本研究首次系统阐明SIX1在AML中的多方面致癌作用，包括增殖、代谢重编程和免疫调节。SIX1通过增强白血病细胞糖酵解并可能通过代谢竞争抑制CD8⁺ T细胞效应功能，从而促进AML进展。这些发现为AML的代谢和免疫联合治疗策略奠定了基础，并提示SIX1是有前景的治疗靶点。