α7nAChR通过CaMKK2/AMPK/mTOR通路促进星形胶质细胞自噬从而缓解脓毒症相关脑病认知障碍

《Frontiers in Immunology》：α7nAChR alleviates cognitive impairment by promoting autophagy in astrocytes via CaMKK2/AMPK/mTOR pathway in sepsis-associated encephalopathy

　　

背景：脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）是继发于脓毒症的脑功能障碍综合征。尽管α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）在SAE中发挥关键作用，但其介导神经炎症反应并参与SAE病理损伤的具体机制仍不清楚。方法：检测所有入组患者血清α7nAChR水平，采用受试者工作特征（ROC）曲线分析α7nAChR水平对SAE风险的预测价值。通过盲肠结扎穿刺（cecal ligation puncture，CLP）构建脓毒症大鼠模型，分别使用PNU282987和甲基牛扁亭碱（Methyllycaconitine，MLA）激活和抑制α7nAChR。采用行为学实验、尼氏染色、高尔基染色和电子显微镜评估认知功能和神经元损伤。通过蛋白质印迹法（Western blot，WB）和透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）检测自噬水平。体外实验中，使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建U118细胞模型。在敲低和过表达α7nAChR后，采用Western blot检测自噬相关蛋白水平，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞上清液炎症因子水平，采用流式细胞术评估细胞内钙离子浓度。结果：SAE患者血清α7nAChR水平低于健康对照组和脓毒症患者，其预测SAE风险的曲线下面积（AUC）为0.79（95% CI，0.68–0.90）。激活α7nAChR可提高大鼠神经行为学评分，增加尼氏小体和突触数量，并改善树突棘形态。激活α7nAChR可减弱星形胶质细胞活化，从而减少IL-1β、IL-6和TNF-α的释放。激活α7nAChR可抑制P62水平，上调LC3表达。体外实验中，α7nAChR促进LPS诱导的U118细胞自噬，增加细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度，升高p-CAMKK2/CAMKK2和p-AMPK/AMPK水平，并降低p-mTOR/mTOR水平。结论：α7nAChR可通过激活Ca²⁺/CaMKK2/AMPK/mTOR信号通路并促进星形胶质细胞自噬，从而缓解SAE中的认知功能障碍。

**α7nAChR经由CaMKK2/AMPK/mTOR通路调控星形胶质细胞自噬以缓解脓毒症相关脑病认知障碍的机制研究**

**一、研究背景与科学问题**

脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy，SAE）是继发于脓毒症的一种弥漫性 cerebral dysfunction 综合征，以认知功能障碍为主要临床表现之一，其发病率和死亡率均较高，已成为重症医学领域的重大公共卫生挑战。海马体被认为是与SAE认知缺陷密切相关的关键脑区。尽管神经炎症、自噬异常和神经元损伤已被报道参与SAE的病理生理过程，但由于其多因素性质及相互作用的复杂性，确切的分子机制仍未完全阐明。星形胶质细胞作为神经系统的关键调节细胞，积极参与神经炎症反应和突触稳态的调控，其功能在SAE诱导的神经元病理过程中常受损。星形胶质细胞来源的突触调节因子——包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）——在调节突触可塑性方面发挥不可或缺的作用。近期研究提示，星形胶质细胞自噬流缺陷可诱导反应性胶质增生，涉及细胞活化及IL-1β和TNF-α等炎症介质释放的增加。相反，增强星形胶质细胞自噬流不仅能改善神经元活性，还能减少凋亡并增强神经功能。因此，探索星形胶质细胞自噬相关机制及其在SAE中的作用具有重要的临床意义。

α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）是一种同源五聚体配体门控离子通道，具有高钙离子（Ca²⁺）通透性，在中枢神经系统中广泛表达，介导记忆、学习和判断等关键认知功能。研究表明，α7nAChR的促认知效应主要由星形胶质细胞上表达的α7nAChR介导。星形胶质细胞α7nAChR通过D-丝氨酸/N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）信号轴维持NMDAR功能，驱动突触后AMPA受体的募集和静默突触的去沉默化，从而增强星形胶质细胞-神经元网络通讯，在维持认知和感觉处理中发挥关键调控作用。此外，α7nAChR还作为脓毒症中胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）活性的临床相关标志物，其高表达与更好的炎症控制和预后相关。然而，α7nAChR在SAE发病中的具体机制仍不清楚。已有报道表明，激活α7nAChR可诱导巨噬细胞自噬，并通过AMPK-mTOR-p70S6K通路在多种疾病中发挥保护作用，但自噬是否参与α7nAChR对SAE的调控尚待阐明。

**二、主要技术方法**

该研究综合运用了临床样本分析和体内外实验体系。在临床层面，研究人员收集了27例SAE患者、34例脓毒症患者及20例年龄匹配的健康对照者的外周血样本，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清α7nAChR水平，并利用受试者工作特征（ROC）曲线评估其对SAE的预测价值。在体内实验中，通过盲肠结紮穿刺（cecal ligation puncture，CLP）构建脓毒症大鼠模型，采用α7nAChR激动剂PNU282987和拮抗剂甲基牛扁亭碱（Methyllycaconitine，MLA）进行药物干预；运用神经行为学评分、开场实验、Y迷宫实验评估认知功能；通过尼氏染色、高尔基染色和透射电子显微镜（TEM）观察神经元损伤和突触形态。在体外实验中，以人星形胶质瘤细胞系U118为模型，使用脂多糖（LPS）诱导炎症损伤，构建α7nAChR过表达和敲低的慢病毒载体，采用Western blot检测自噬相关蛋白和信号通路蛋白表达，ELISA检测炎症因子水平，流式细胞术检测细胞内Ca²⁺浓度。研究人员还使用了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）、自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin）、Ca²⁺动员剂毒胡萝卜素（Thapsigargin）和Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM进行机制验证。

**三、研究结果**

**1. 血清α7nAChR表达在SAE患者中下调**：临床数据显示，SAE患者血清α7nAChR浓度（6.42 ± 2.99 ng/mL）显著低于脓毒症组（7.29 ± 1.77 ng/mL，p = 0.010）和健康对照组（19.16 ± 2.52 ng/mL，p < 0.001）。ROC曲线分析表明，α7nAChR区分SAE与其他状况的曲线下面积（AUC）为0.79（95% CI，0.68–0.90，p < 0.001），优于SOFA评分、APACHE II评分及TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子。此外，α7nAChR水平与APACHE II评分呈显著负相关（r = -0.65，p < 0.001）。

**2. 激活α7nAChR减轻炎症并提高生存率**：在CLP诱导的脓毒症大鼠模型中，α7nAChR激动剂组7天生存率为55%，显著高于CLP组（20%）和α7nAChR拮抗剂组（30%）。ELISA结果显示，α7nAChR激动显著降低了海马组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，而α7nAChR拮抗剂则逆转了这一效应。

**3. 激活α7nAChR改善认知功能障碍并减轻神经元损伤**：神经行为学评分显示，α7nAChR激动剂组大鼠评分（7.17 ± 0.98）显著高于CLP组（4.67 ± 0.82，p < 0.01）。开场实验和Y迷宫实验进一步证实，α7nAChR激活可改善CLP大鼠的运动探索能力和空间工作记忆。尼氏染色显示α7nAChR激动剂组海马神经元数量显著增加；高尔基染色显示树突棘密度和形态明显改善；透射电镜观察到突触数量显著增多。

**4. 激活α7nAChR减弱星形胶质细胞活化并恢复自噬**：免疫荧光和Western blot结果显示，CLP诱导了海马区胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞活化，表现为细胞体增大、突起增粗缩短，而α7nAChR激活显著抑制了这一反应。自噬相关蛋白检测显示，α7nAChR激动剂组LC3B-II水平进一步升高，P62水平降低。LC3B与GFAP的双重免疫荧光染色显示，α7nAChR激活增加了星形胶质细胞中LC3B与GFAP的共定位水平。透射电镜观察到α7nAChR激动剂组自噬体数量进一步增加。

**5. 过表达α7nAChR通过Ca²⁺/CAMKK2/AMPK/mTORC1通路促进U118细胞自噬**：体外实验中，α7nAChR过表达可降低LPS诱导的U118细胞炎症因子释放，降低P62表达并增加LC3表达。流式细胞术检测显示α7nAChR过表达增加了细胞内Ca²⁺浓度，Western blot结果显示p-CAMKK2（Ser511）和p-AMPK（T172）水平升高，p-mTOR（Ser2448）水平降低。

**6. 敲低α7nAChR通过Ca²⁺/CAMKK2/AMPK/mTORC1通路抑制U118细胞自噬**：与过表达结果相反，α7nAChR敲低导致炎症因子水平升高，LC3表达下调、P62上调，细胞内Ca²⁺浓度降低，p-CaMKK2和p-AMPK磷酸化水平降低，p-mTOR磷酸化水平升高。使用Thapsigargin和BAPTA-AM的干预实验进一步验证了Ca²⁺和CaMKK2/AMPK/mTORC1通路在α7nAChR诱导的星形胶质细胞自噬中的介导作用。

**四、讨论与结论**

本研究从临床样本、动物模型和细胞实验三个层面系统阐明了α7nAChR在SAE中的保护作用及其分子机制。研究结果表明，α7nAChR可通过增加星形胶质细胞内Ca²⁺内流，激活CaMKK2/AMPK/mTOR信号通路，促进星形胶质细胞自噬，抑制其活化和炎症因子释放，从而减轻神经元损伤并改善认知功能障碍。

在讨论部分，研究人员指出，血清α7nAChR水平在SAE患者中显著降低且具有较高的诊断预测价值（AUC = 0.79），提示其可能作为SAE的非侵入性生物标志物。鉴于海马区α7nAChR蛋白表达在SAE啮齿动物中显著下降且与认知功能障碍相关，循环α7nAChR水平可能部分反映中枢胆碱能缺陷状态。研究还强调了自噬在SAE中的双相作用：急性期自噬抑制可减轻神经炎症，而恢复期适当的自噬活性有助于清除受损细胞器。本研究证实，α7nAChR介导的星形胶质细胞自噬代表了细胞类型靶向的治疗策略。钙离子作为自噬的重要调节因子，通过钙/钙调蛋白依赖性激酶β（CaMKKβ/CAMKK2）和AMP活化蛋白激酶（AMPK）通路发挥作用，最终抑制mTOR活性。本研究通过Ca²⁺动员剂和螯合剂的干预实验证实了这一通路。

研究人员也坦诚指出了研究的局限性：临床队列样本量相对较小；缺乏纵向随访数据；未在体内进行该通路的直接药理学抑制实验；U118细胞系源于人星形胶质瘤，存在PTEN缺失和p53突变等遗传改变，可能影响信号通路。

结论：α7nAChR通过促进CaMKK2/AMPK/mTOR依赖性自噬和抑制星形胶质细胞炎症反应，减轻脓毒症诱导的神经元损伤和认知功能障碍，其机制可能与α7nAChR介导的星形胶质细胞Ca²⁺内流增加有关。该研究为SAE的病理机制提供了新的见解，也为SAE的治疗提供了潜在的新药靶点。