《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Oncofetal antigens as emerging targets in chimeric antigen receptor (CAR)-T cell-based immunotherapies: opportunities and challenges
癌胚抗原（oncofetal antigens）因其发育期限制性表达及在恶性细胞中的频繁重现，正成为基于嵌合抗原受体（CAR）的免疫治疗的新兴靶点。这些抗原与细胞可塑性（cellular plasticity）、干细胞样程序（stem-like programs）、免疫逃逸（immune evasion）及对细胞毒性疗法的耐药性密切相关，使其在生物学上具有高度吸引力的靶点特征。多种癌胚抗原已作为CAR-T细胞靶点进入早期临床试验，并在神经母细胞瘤（neuroblastoma）和弥漫性中线胶质瘤（diffuse midline gliomas）等多种癌症中显示出令人鼓舞的结果。然而，在大多数实体恶性肿瘤中，抗肿瘤疗效迄今仍然有限。这反映了共同的障碍，包括在正常组织中的低水平表达、瘤内抗原异质性（intratumoral antigen heterogeneity）、肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）内的免疫抑制、CAR-T细胞耗竭（exhaustion）以及有限的持久性（persistence）。在本篇小型综述（Mini-Review）中，研究人员讨论了癌胚抗原表达的生物学基础，综合了以CAR-T细胞疗法靶向这些抗原的临床和临床前经验，并重点介绍了旨在克服当前局限性的新兴工程和联合策略。研究人员提出，整合发育生物学、肿瘤进化和免疫工程学的原理，对于释放癌胚抗原导向的CAR-T疗法在实体瘤中的治疗潜力至关重要。
引言
嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是一种基于细胞的免疫疗法，通过基因工程改造T细胞，使其识别并清除表达特定细胞表面靶标的细胞。CAR-T细胞疗法已彻底改变了多种血液系统恶性肿瘤的治疗格局，目前已有七种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的产品，在原本难治性疾病中实现了高缓解率和持久缓解。然而，将这一成功转化为实体瘤的治疗一直困难重重。与血液系统癌症不同，实体瘤存在诸多障碍，包括免疫浸润不良、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、肿瘤抗原异质性以及肿瘤细胞逃逸机制。血液系统肿瘤与实体瘤之间的另一个关键区别在于谱系限制性靶点的可用性。CD19和B细胞成熟抗原（BCMA）等抗原主要局限于B细胞谱系，清除表达这些抗原的细胞所产生的后果可控。而在实体瘤中，大多数候选抗原与必需正常组织共享，导致治疗窗狭窄，激进靶向时会产生不可接受的毒性。
癌胚抗原为这一挑战提供了潜在解决方案。这些蛋白质在胚胎/胎儿发育期间表达，在大多数分化的成人组织中被表观遗传沉默，并在癌症中重新表达。重要的是，癌胚抗原的表达通常在低分化和治疗抵抗性癌症中富集——这正是最需要新疗法的情境。其发育期限制性表达提示肿瘤特异性，而其与侵袭性肿瘤行为的关联则暗示其与恶性进展具有生物学相关性。尽管癌胚抗原具有有利特征，但以癌胚抗原为导向的CAR疗法迄今临床获益有限。理解其原因不仅需要考虑抗原表达模式，还需考虑免疫耐受、肿瘤细胞可塑性、选择压力和CAR-T细胞生物学。在本小型综述中，研究人员将综合当前关于癌胚抗原CAR-T靶向治疗实体瘤的知识基础和新兴进展。
癌胚抗原生物学
癌胚重编程与癌症可塑性
癌胚抗原通常由经历了癌胚重编程的癌细胞表达，这一过程赋予癌症有利的表型，包括对毒性物质的抵抗、免疫调节、快速增殖和血管生成。癌胚重编程日益被认为是一种动态且可逆的细胞状态，而非固定的分化终点。在单个肿瘤内，部分细胞亚群可能响应低氧、化疗、营养缺乏或免疫压力而短暂采用胎儿样程序。这种可塑性加剧了瘤内异质性并促进肿瘤进化。重要的是，癌胚细胞状态常在治疗后富集，提示癌胚抗原表达可能标记导致复发的残留病灶群体。这一关联加强了将癌胚抗原作为治疗靶点的理论依据，但也引入了复杂性，因为针对这些状态的选择压力可能驱动肿瘤适应。
个体癌胚抗原对包括癌症治疗在内的不同刺激表现出动态表达变化。例如，癌胚抗原（CEA）的表达在化疗和放疗后均升高。癌胚抗原表达的可塑性可能反映了表观遗传调控，如紧密连接蛋白claudin-6（CLDN6）受启动子甲基化下调，而经甲基转移酶抑制剂处理导致去甲基化后表达上调。抗原密度对CAR-T活性至关重要，癌胚抗原靶向CAR-T疗法的时机和效用可能受到先前或同步治疗方案的显著影响。
免疫耐受及其对CAR设计的启示
从免疫学角度看，癌胚抗原是在胸腺发育期间表达的自身蛋白。因此，识别这些抗原的高亲和力常规T细胞受体（TCR）通过中枢和外周耐受机制被删除或耐受化，从而限制了针对这些抗原的内源性T细胞应答。CAR通过将抗体来源的抗原识别结构域与强效T细胞信号模块偶联，绕过这些屏障，实现对自身来源蛋白的MHC非依赖性识别。虽然这允许有效靶向癌胚抗原，但也消除了耐受所施加的安全约束，当抗原表达并非严格肿瘤限制性时，会增加靶向肿瘤外毒性（on-target off-tumor toxicity）的风险。因此，癌胚抗原是否适合作为CAR靶点，不仅取决于肿瘤与正常组织之间的差异表达，还取决于表达密度、组织分布、分子同源性以及工程化具有适当敏感性和特异性CAR的能力。
靶向癌胚抗原的CAR-T细胞临床经验
癌胚抗原需在细胞表面表达才能被CAR靶向。多种癌胚抗原已进入临床试验，研究人员将在此讨论。
癌胚抗原（CEA）
CEA是首个被鉴定的癌胚抗原，至今仍是评估最广泛的靶点之一。它在多种上皮恶性肿瘤中表达，尤其是结直肠腺癌，但在正常胃肠道和呼吸道上皮中也可检测到低水平表达。在组织微阵列中，CEA在13,725例肿瘤中的31.5%和120种肿瘤类型中的65种中可检测到。在胎儿发育和健康成人组织中，CEA主要介导细胞黏附功能。在成人癌症中，其过表达通过增强肿瘤细胞黏附、抑制凋亡和促进免疫逃逸来推动疾病进展。CEA靶向CAR-T细胞的临床试验，无论是全身给药还是局部给药，均显示出有限的抗肿瘤应答。靶向CEA的主要挑战是其高正常组织表达；一项使用第一代CEA靶向CAR-T细胞的试验因急性呼吸毒性而提前终止。
Claudin-6
Claudin-6是一种较新鉴定的癌胚蛋白，在多种胎儿组织中表达，但在儿童和成人中几乎不表达。它在多种儿童和成人癌症中重新表达，包括生殖细胞肿瘤、卵巢癌和子宫内膜癌。在健康状态下，紧密连接蛋白claudin-6在胎儿上皮分化中发挥作用。在恶性肿瘤中，claudin-6促进癌细胞存活、增殖和侵袭。最近一项针对CLDN6阳性成人肿瘤患者的CLDN6靶向CAR-T（联合RNA疫苗）的1期试验显示毒性可控，并显示出疗效证据，未经确认的客观缓解率（ORR）为33%。虽然该试验仍在进行中（NCT04503278），但一项计划在生殖细胞肿瘤患者中开展的2期试验（NCT06940804）在招募任何患者前已被撤回。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）
GPC3是一种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，在胎儿肝脏发育期间表达，并在肝细胞癌（HCC）和某些其他恶性肿瘤中重新表达。然而，它在包括肺在内的多种正常组织中也有表达。GPC3被认为在胚胎发生过程中调节细胞增殖和凋亡。在癌症中，GPC3调节包括Wnt和Hippo/YAP在内的信号通路，以避免凋亡并促进上皮-间质转化（EMT）。遗憾的是，GPC3靶向CAR-T细胞的疗效有限。在一项1期试验中测试的GPC3 CAR-T细胞未诱导抗肿瘤应答，但耐受性良好。
受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）
ROR1是一种1型受体酪氨酸激酶，在包括肺癌和乳腺癌在内的多种肿瘤中高表达，正常组织分布有限。在胚胎发生中，ROR1在神经、心肺和骨骼发育中具有重要作用。在实体瘤中，ROR1具有多种功能，包括调节凋亡和增强表皮生长因子受体（EGFR）信号传导。一项针对三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）的ROR1 CAR-T细胞1期试验显示毒性可控，但疗效甚微，仅有一名患者出现短暂的部分缓解。
肿瘤相关糖蛋白（TAG）72
TAG72于1986年被鉴定为癌胚抗原，正常组织表达极低，但在包括乳腺癌、结肠癌和NSCLC在内的多种癌中过表达。TAG72通常在分泌期子宫内膜中表达，并在早期妊娠中诱导抗炎性树突状细胞。其在癌症中的作用尚不清楚，但可能与免疫逃逸有关。20世纪90年代首次人体CAR-T细胞试验即靶向TAG72，虽然未观察到明确的靶向肿瘤外毒性，但也没有影像学缓解。TAG72作为CAR靶点的开发在过去十年中一直有限，但目前至少有一项靶向TAG72的CAR-T细胞临床试验正在进行中（NCT05225363）。
神经节苷脂G2（GD2）
GD2是一种糖鞘脂，在胎儿发育中的神经外胚层细胞上高表达，在成人组织（如中枢神经系统）中表达较低。GD2通常在源自神经外胚层的肿瘤细胞（黑色素瘤、神经母细胞瘤、小细胞肺癌）上上调。在胚胎发生中，GD2在神经元分化中发挥作用。在癌症中，GD2在黏附、血管生成、细胞存活和TME中具有功能。GD2 CAR-T细胞在高危转移性、复发或难治性神经母细胞瘤儿童中已显示出高效力，5年总生存率为68%。GD2 CAR-T细胞在弥漫性中线胶质瘤的治疗中也显示出前景，一项1期试验中一名患者在治疗后30个月仍保持持续的完全缓解。
新兴癌胚抗原靶点
还有其他几种癌胚抗原已在临床前环境中作为CAR靶点进行测试，包括以下所列。
5T4（滋养层糖蛋白）
5T4是一种在胚胎细胞和滋养层中发现的糖蛋白。它在包括多种软组织肉瘤在内的许多癌症中高表达，在若干成人组织中低表达。在胎儿发育中，5T4被认为在促进细胞迁移方面很重要。在恶性肿瘤中，5T4在EMT、迁移和调节Wnt信号传导中发挥作用。第二代5T4靶向CAR-T细胞已在体外和体内显示出抗肿瘤活性。
癌胚腱糖蛋白-C（TNC）
TNC是一种分泌型细胞外基质（ECM）蛋白，通过表面受体与细胞结合，并在免疫组织化学中具有膜定位。人类存在多种TNC异构体，其中包含额外结构域C的异构体（EDC-TNC）是癌胚性的，在胎儿发育和包括肺癌和脑癌在内的多种癌症中发现，正常组织表达极低。在健康状态下，TNC调节增殖、黏附并维持炎症。在恶性肿瘤中，TNC具有调节TME、EMT和促进免疫逃逸等功能。EDC-TNC靶向CAR-T细胞显示出对EDC-TNC阳性肿瘤细胞的特异性杀伤。
纤连蛋白额外结构域B（EDB-FN）
EDB-FN是一种癌胚剪接变体。它在成人组织中表达低（仅限于胃肠道和卵巢），但在包括NSCLC、乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌在内的许多癌症中高表达。在正常发育中，EDB-FN被认为调节结缔组织细胞的生长。在癌症中，EDB-FN可调节黏附、血管生成和免疫细胞。虽然EDB-FN由癌细胞分泌，但它黏附于其表面，使其能够作为CAR靶点。靶向EDB-FN的CAR-T细胞在体外和异种移植小鼠中均具有抗肿瘤活性。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2（GPC2）
GPC1和GPC2是在胚胎发生中高表达、在多种成人组织中低表达的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。GPC1在包括肺癌和前列腺癌在内的多种癌症中上调。GPC2在包括髓母细胞瘤在内的多种儿童癌症以及包括脑癌和肺癌在内的成人肿瘤中上调。GPC1和GPC2在神经元发育中发挥作用。在恶性肿瘤中，GPC1和GPC2在细胞存活和增殖中发挥作用。GPC1 CAR-T细胞联合PD-1阻断在体外和体内对结肠癌显示出疗效。GPC2 CAR-T细胞对神经母细胞瘤和髓母细胞瘤的体外和体内模型具有抗肿瘤活性。
受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（ROR2）
与ROR1类似，ROR2在包括肾癌在内的多种癌症中表达，在大多数成人组织中不表达。在胚胎发生过程中，ROR2对肢体和神经系统的形成很重要。ROR2可通过介导Wnt信号传导发挥癌基因作用。ROR2 CAR-T细胞在体外和体内对肾癌有效。虽然临床验证是必要的，但这些新兴靶点显示出巨大前景。许多新兴靶点与已在临床试验中测试的靶点具有相似性，但可能具有更好的肿瘤限制性，从而可能限制靶向毒性。EDC-TNC和EDB-FN的独特之处在于它们是分泌型蛋白，可与癌细胞结合，可能减少抗原异质性；这是否能改善CAR-T杀伤效果仍需进一步研究。
靶向癌胚抗原：挑战与策略
近期针对实体瘤的癌胚抗原靶向CAR-T细胞试验总体耐受性良好，并在有限癌症中显示出令人鼓舞的结果，尤其是神经母细胞瘤和弥漫性中线胶质瘤。虽然这表明了靶向癌胚抗原的潜力，但在许多癌症中临床疗效仍令人失望。为克服这些限制应答的障碍，正在开发多种策略以改善预后。
正常组织表达
癌胚抗原最初因其存在于胎儿和肿瘤组织中而正常组织缺失而被发现。随着现代更灵敏技术的使用，研究表明许多癌胚抗原确实在正常成人组织中有低水平表达。因此，靶向肿瘤外毒性是癌胚抗原的主要关注点，并且可能是临床试验中部分毒性的原因。选择具有肿瘤限制性表达的癌胚抗原是预防靶向肿瘤外毒性的一种方法。胎儿、成人和癌组织的大规模转录组数据库是识别癌胚限制性表达的关键。虽然许多常见癌症存在大型癌症表达数据集，但对于罕见癌症，此类数据较少。结合较小数据集的专项工作可以识别罕见癌症中有前景的癌胚抗原。解决正常组织中癌胚抗原表达的另一种方法是通过先进的CAR工程实现更安全的靶向。例子包括“逻辑门控”（logic gating），一种在特定分子存在或缺失时阻止CAR-T细胞激活的策略，有潜力限制靶向肿瘤外毒性。Sandberg等人开发了抗CEA CAR-T细胞，其同时表达一种新型基于白细胞免疫球蛋白样受体1（LIR-1）的受体，在HLA-A02存在时阻止CAR-T激活。他们证明了该策略在体外和体内对不表达HLA-A02的癌细胞具有选择性抗肿瘤疗效。
肿瘤抗原异质性与逃逸
几乎没有哪种蛋白质在实体瘤的每个细胞中均表现出普遍高表达，癌胚抗原也不例外。除了限制对肿瘤的疗效外，异质性表达还为肿瘤在选择压力下针对靶蛋白的进化提供了底物，从而导致抗原逃逸。克服低抗原表达的一种策略是同时靶向多种抗原。表达靶向TAG72和CD47双CAR的CAR-T细胞被发现对TAG72低表达癌细胞的体外杀伤有所改善。CD47是癌细胞上表达的巨噬细胞“别吃我”信号，但也存在于正常细胞上。该研究中的CD47 CAR缺乏信号结构域，意味着该CAR仅增强结合以促进通过TAG72 CAR的CAR-T激活。还有其他几种策略可克服抗原逃逸，包括上调靶抗原和促进旁观者杀伤。
CAR-T特性
独立于肿瘤细胞和TME，CAR-T内在特征可影响其持久性、耗竭和细胞毒性能力。为提供稳健的肿瘤控制，CAR-T细胞需要长期存活和持续存在。血液中CAR-T的持久性与血液系统癌症和神经母细胞瘤的长期无病生存相关。确保持续抗原暴露是增强持久性的一种策略，但有耗竭风险。Reinhard等人将CLDN6 CAR-T细胞与编码CLDN6的RNA疫苗联合使用，并在小鼠中证明该策略改善了CAR-T扩增、持久性和肿瘤控制。该策略在随后的临床试验中得到应用，确实显示出客观缓解，但RNA疫苗是否比单独使用CLDN6 CAR-T细胞更能提高疗效尚不清楚。
为在长期内有效清除癌细胞，CAR-T细胞需要避免耗竭。重要的是，CAR-T细胞的设计可在其遇到肿瘤之前导致耗竭。例如，强直性CAR信号可诱导早期CAR-T耗竭并限制抗肿瘤功能。条件性CAR表达可避免这种强直信号。通过缺氧反应元件控制CEA-CAR表达，在小鼠模型中减少了耗竭证据并改善了抗肿瘤控制。在一项1期试验中，这些缺氧反应性CEA-CAR-T细胞通过腹腔（IP）或静脉（IV）给药。剂量限制性毒性为腹泻，但即使在测试剂量下，IP给药ORR为23.5%，而IV仅为8%。
CAR-T制造也可影响其性能。在血液系统恶性肿瘤中有大量证据表明，起始T细胞和输注前产品中CAR-T细胞的最终表型影响临床结局。最终的CAR-T产品是制造过程的产物；激活和培养条件、持续时间以及冷冻保存均影响CAR-T产品，优化这些因素可能改善CAR-T疗效。
CAR-T激活的预期结果是靶细胞杀伤。CAR-T细胞通常通过释放颗粒酶和穿孔素诱导凋亡。诱导免疫原性细胞死亡（如坏死性凋亡、焦亡或铁死亡）可在肿瘤细胞对凋亡耐药时实现肿瘤细胞杀伤，并触发内源性免疫系统实施旁观者杀伤。例如，ROR1 CAR-T细胞与药理学诱导铁死亡相结合，在体外和体内改善了肿瘤控制。
最佳CAR表达细胞
本综述中讨论的临床证据以CAR-T细胞为主；这是否是最佳细胞类型尚不清楚。已有将癌胚抗原靶向CAR表达于替代细胞类型（主要是NK细胞和巨噬细胞）的临床前开发。GPC3靶向CAR-巨噬细胞和CAR-NK细胞在多种模型中显示出对HCC的抗肿瘤疗效，CLDN6靶向CAR-NK细胞在体外和体内显示出对卵巢癌细胞的杀伤。目前尚未有CAR-巨噬细胞、CAR-NK细胞和CAR-T细胞之间的直接比较，最佳细胞类型可能取决于具体情况，例如分期、癌症类型、时间点和既往治疗。
肿瘤微环境（TME）
实体瘤TME是所有CAR-T细胞的主要障碍。TME带来的挑战包括运输受损、免疫抑制信号和免疫检查点。由于多种复杂的免疫抑制过程，T细胞和其他免疫细胞通常表现出功能障碍表型，阻碍有效的抗肿瘤效应功能。为克服TME免疫抑制，正在研究多种策略；一种是“装甲”CAR-T细胞，例如通过工程化细胞因子释放或利用细胞因子驱动的信号。已测试多种细胞因子，包括IL-15和IL-18，它们被证明可改善抗肿瘤疗效。例如，在骨肉瘤小鼠模型中，EDC-TNC靶向CAR-T细胞的疗效通过共表达一种基于模块化亮氨酸拉链的嵌合细胞因子受体（旨在激活IL-18信号通路）而显著增强。此外，IL-15装甲的抗GPC3 CAR-T细胞已在早期临床试验中测试，装甲构建体ORR为33%，而未装甲为0%。共表达特定转录因子也可能有助于克服TME带来的障碍。例如，Runt相关转录因子3（RUNX3）调节TME中的T细胞浸润，其在GPC3靶向CAR-T细胞中的共表达改善了体内浸润和抗肿瘤疗效。这些CAR-T细胞的1期试验未显示意外不良事件，但疗效有限，ORR为16.7%。与现有疗法（如放疗）联合也为调节TME以改善CAR-T疗效提供了希望。在一项针对重度预处理的CEA阳性肝转移患者的1期试验中，CEA CAR-T细胞肝动脉输注联合选择性内放射治疗的中位总生存期为8个月。
患者选择
除上述挑战外，选择正确的患者接受CAR-T细胞治疗对其成功至关重要。通过免疫组织化学（IHC）检测肿瘤组织上CAR靶标的表达是本研究讨论的大多数临床试验的关键纳入因素。然而，使用IHC的抗原表达不一定能预测对CAR-T的应答。关键原因包括空间和时间异质性、依赖单一且通常是历史的活检样本，以及难以定义抗原阳性和最小抗原密度阈值。这些问题已导致一些临床试验取消了抗原表达作为合格标准，例如一项研究间皮素CAR-T细胞的1期研究（NCT03054298）。包括定量抗原密度分析和基于影像的伴随诊断在内的新技术可能更好地指导患者选择。
未来展望
癌胚抗原是涵盖多种恶性肿瘤（包括罕见肿瘤）的CAR-T细胞疗法的有前景靶点。肉瘤等罕见癌症研究不足，转移性情况下预后不良。值得注意的是，多种癌胚抗原在多种肉瘤亚型中表达。例如，5T4存在于滑膜肉瘤、纤维肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、未分化多形性肉瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤和胃肠道间质瘤中。因此，将罕见肿瘤患者纳入癌胚抗原靶向疗法的临床试验可能使服务不足的患者群体受益。
存在多重障碍阻碍靶向癌胚抗原的CAR成功，正如单独使用第一代和第二代CAR-T细胞令人失望的临床疗效所证明的那样。上述策略在改善临床有效性方面显示出前景。然而，靶向癌胚抗原的主要挑战之一与癌细胞本身有关；癌胚重编程通常不是固定的，任何时间点可能只有一部分癌细胞处于癌胚状态。因此，针对癌胚抗原的选择压力很可能选择低表达靶抗原的非胎儿样细胞状态。尽管如此，用CAR-T细胞靶向治疗抵抗性癌胚细胞状态，单独或与针对其他肿瘤细胞状态的疗法联合，可能改善肿瘤控制。癌胚重编程的可塑性也提供了在CAR-T细胞治疗前增加表达靶抗原的肿瘤细胞比例的机会。例如，卵巢癌中CLDN6的表达受细胞密度、卡铂暴露和TGF-β信号传导的影响。更好地理解癌胚重编程可能因此增强癌胚靶向CAR-T细胞的疗效。
结论
癌胚抗原代表了一类有前景的CAR-T细胞靶点，适用于常见和罕见恶性肿瘤。其中多种已进入临床评估，虽然早期应答有限，但CAR工程和联合策略的进展正开始改善治疗疗效。多种新兴癌胚抗原正在扩大靶点库，其与旨在克服CAR-T细胞活性关键障碍的策略相结合具有相当大的前景。对癌胚重编程的更深入理解可能进一步揭示新的靶点和治疗机会。
