《Biotechnology and Bioengineering》：Induction and Enhancement of Bacteriocin Production (Review)
编辑推荐：
传统上，细菌素由微生物在复杂底物上产生，并以半纯化制剂或粗发酵液的形式释放。这些含细菌素的产品通常纯度不理想、活性物质含量低且生产成本高，限制了其商业化和应用。本综述旨在分析改进高质量含细菌素产品生产的现有方法。通过选择最高产的菌株，以及通过诱变和基因工程对生
传统上，细菌素由微生物在复杂底物上产生，并以半纯化制剂或粗发酵液的形式释放。这些含细菌素的产品通常纯度不理想、活性物质含量低且生产成本高，限制了其商业化和应用。本综述旨在分析改进高质量含细菌素产品生产的现有方法。通过选择最高产的菌株，以及通过诱变和基因工程对生产者进行定向改造，可提高细菌素产量。通过调整非营养性和营养性环境因素来优化生产条件，以及与细菌素诱导微生物共培养，也能提高菌株的产细菌素能力。依赖于“试错”范式的传统方法既不能保证最大细菌素产量或最终产品的纯度，也无法消除生产过程的高复杂性、劳动密集型和资源密集型特点。现代解决方案驱动的方法利用系统生物学、计算建模和人工智能，正转向对高效“细胞工厂”进行理性的、理论预测的设计。传统的生产者培养是一个耗时的过程，需要几天到几周的时间，并且需要对每个物种进行单独研究。无细胞蛋白合成（CFPS）极大地加速了体外高纯度细菌素的生产，将过程缩短至数小时。先进方法和技术的实施为成功放大高质量细菌素生产、降低过程的复杂性和资源强度开辟了前景，从而加速其在医疗实践和食品工业中的商业化与应用。
1 引言
细菌素是由微生物核糖体合成的抗菌肽，旨在通过抑制或杀死密切相关甚至不相关的竞争物种，在微生物群落中获得竞争优势。由于其对包括临床重要和多重耐药病原体在内的广泛微生物具有有效性，它们被视为传统抗生素在医学领域的有前景补充或替代品。在食品工业中，它们可作为化学防腐剂的替代品。此外，细菌素在抗病毒和抗癌活性方面有应用前景，并可用于改善口腔健康。目前，乳链菌肽（nisin）和片球菌素PA-1（pediocin PA-1）是商业化用于特定食品防腐的细菌素。其他细菌素尚无标准化的商业制剂。细菌素由天然生产者生物体在复杂底物上产生，并以半纯化制剂或粗发酵液形式释放。含细菌素产品的特点是纯度不理想且活性细菌素含量低。工业规模生产受到高成本的显著限制，其中下游加工可能占总生产成本的80%-90%。本综述旨在分析优化高质量含细菌素产品生产的现有方法。目前，用于诱导和/或增强细菌素生产的方法包括传统的细胞和环境靶向策略，以及现代的解决方案驱动替代技术，包括无细胞蛋白合成（CFPS）。
2 细胞生物生产系统
2.1 针对细胞的诱导和/或增强细菌素生产的方法
2.1.1 筛选和选择最高产菌株
野生菌株的细菌素产量普遍较低。为确保高效生产，需仔细筛选、选择并测试菌株对病原体的高抗菌活性。
2.1.2 改造生产菌株
为最大化细菌素的产量和活性，需对生产菌株进行改造。诱变和基因工程是两种主要工具。
2.1.2.1 诱变
不同性质的诱变剂被成功用于诱导细菌基因组突变，从而产生具有更高细菌素产量和/或活性的突变株。物理诱变使用物理因子如紫外线（UV）和常压室温等离子体（ARTP）等诱导突变。化学诱变主要使用烷化剂、碱基类似物等化学品。生物诱变包括噬菌体和质粒诱变、原生质体融合等技术。复合诱变指同时或顺序使用两种或多种不同诱变因子。适应性实验室进化（ALE）是一种基于长期环境压力选择有益突变的非理性工程技术。
2.1.2.2 遗传/代谢工程技术
将细菌细胞转化为高效“细胞生物工厂”有多种途径。启动子交换和核糖体结合位点（RBS）工程分别在转录和翻译水平调控基因表达。增加关键生物合成基因拷贝数可提高表达量。当天然生产者生长缓慢或难以培养时，异源表达系统可将生物合成基因簇转移至“细胞工厂”。CRISPR-Cas9基因编辑技术可通过精确编辑细菌基因组来增强细菌素产量。
2.1.2.3 现代解决方案驱动替代方法的特点
现代优化微生物生产力的策略特征是从随机诱变转向使用系统生物学和人工智能（AI）合理设计高性能“细胞工厂”。系统生物学使建模能够识别最强的基因表达“驱动因子”并重新设计基因序列。基因组规模代谢模型（GEM）可识别限制肽合成的代谢瓶颈并预测最佳营养物。机器学习（ML）越来越多地用于自动化和改进GEM的重建与管理。
2.2 针对环境的诱导和/或增强细菌素生产的方法（细菌素生产条件优化）
细菌素的产生取决于多种环境因素。营养因子如碳源和氮源的类型和浓度显著影响细菌素生成。非营养因素如pH值、温度、搅拌和通气也至关重要。应激因素如营养限制也可刺激其产生。传统“单参数一次变化”（OPAT）方法已被响应面法（RSM）和人工神经网络（ANN）等统计方法成功取代。
2.2.3 开发共培养诱导的细菌素生产系统（细菌素产生菌与细菌素诱导微生物的共培养）
在非竞争条件下，细菌素感受态菌株保持低水平的细菌素生产。引入诱导微生物是一种有效的诱导方式。诱导微生物可以是与生产者系统发育关系密切或相当遥远的细菌或真菌。共培养中两种细菌接种物的比例是细菌素诱导的关键参数。关于诱导效应是否需要活细胞间的直接接触存在不同观点。真菌也可诱导细菌产生细菌素，机制涉及激活细胞间通讯机制或消除乳酸等限制性代谢副产物。尽管取得了显著进展，但共培养中相互作用的一些分子方面仍不清楚。
3 无细胞生物生产系统：无细胞蛋白合成（CFPS）
无细胞系统已成为一种有前景的新替代方案。CFPS平台能够快速进行基因组分析、筛选和控制性过量生产羊毛硫肽。UniBioCat（统一生物催化系统）基于无细胞基因表达，用于核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs）的快速生物合成和工程化。只需数小时即可获得成熟的RiPPs，而传统方法可能需要数天或数周。PARAGEN 1.0基因库包含了所有用于体外无细胞肽合成的遗传元件，可在2-3小时内完成细菌素生产。CFPS相比体内细胞生物生产的主要优势包括：无细胞毒性限制，允许高产量合成对活宿主细胞有害的抗菌肽；直接控制代谢通量，将100%资源用于细菌素翻译；简化下游处理，无需细胞裂解步骤。
