低剂量PFNA暴露通过巨噬细胞中caspase-11依赖性非经典NLRP3炎症小体激活加剧肠道炎症

《Journal of Advanced Research》：Low-dose PFNA exposure exacerbates intestinal inflammation via caspase-11-dependent noncanonical NLRP3 inflammasome activation in macrophages

　　

摘要：全氟和多氟烷基物质（PFASs）已被认为可促进肠道炎症的进展，然而其具体机制尚不清楚。本研究旨在阐明PFASs通过直接影响巨噬细胞而加剧炎症性肠病（IBD）进展的机制，探究其潜在的分子机制，并探索潜在的干预措施。研究人员利用原代小鼠腹膜巨噬细胞（PMs）和慢性结肠炎模型，研究三种典型PFASs——全氟辛酸（PFOA）、全氟壬酸（PFNA）和全氟癸酸（PFDA）对IBD进展的影响，以阐明其潜在机制和可能的干预措施。研究发现，在环境相关浓度下，PFNA诱导了显著的促炎反应，其特征为IL-1β和IL-18的显著上调。机制上，PFNA激活了caspase-11依赖性非经典NLRP3炎症小体，从而诱导caspase-1、N-GSDMD、IL-1β和IL-18的剂量依赖性上调。caspase-11敲低和Z-VAD-FMK抑制均可减轻这些炎症效应。分子对接提示PFNA可能通过与pro-caspase-11相互作用诱导NLRP3炎症小体激活。在体内，PFNA也通过相同途径加剧了IBD进展。相反，基于研究人员先前的研究，杨梅素可通过抑制caspase-11/NLRP3轴减轻PFNA诱导的炎症。研究揭示了一条PFNA加剧肠道炎症的分子轴，并确定杨梅素是PFNA暴露相关IBD的潜在干预措施。这些发现为PFNA诱导的肠道毒性机制提供了见解，并可能指导制定减轻PFNA相关肠道炎症的策略。

论文解读：低剂量PFNA暴露通过巨噬细胞caspase-11依赖性非经典NLRP3炎症小体激活加剧肠道炎症

全氟和多氟烷基物质（PFASs）是一类在碳链上部分或全部取代氢原子的持久性有机污染物（POPs），因其优异的疏水性、疏油性和稳定性而被广泛应用。全氟辛酸（PFOA）和全氟辛烷磺酸（PFOS）是早期使用最广泛的PFAS同类物，随着其健康危害的报道，全氟壬酸（PFNA）和全氟癸酸（PFDA）等作为主要替代品被采用。目前，PFOA、PFNA和PFDA在多种环境介质中普遍存在，并在人体血清样本中被频繁检出。尽管流行病学研究已将PFAS暴露与炎症性肠病（IBD）风险增加相关联，但多数研究采用远超环境相关人类暴露水平的剂量，且主要集中在PFAS与肠道微生物群或屏障功能的关系上，对其潜在分子机制的研究有限。巨噬细胞作为IBD炎症级联反应中的关键效应细胞，PFAS暴露对其的影响尚未充分阐明。研究人员前期工作表明PFDA通过cGAS/STING/NF-κB轴加剧IBD，但其他PFAS促进肠道炎症的机制仍不清楚。NLRP3炎症小体已被确定为驱动IBD进展的核心机制之一，然而PFAS是否通过NLRP3炎症小体激活诱导肠道炎症尚待探索。杨梅素作为一种具有多种药理活性的天然黄酮类化合物，在多种炎症模型中显示出保护潜力，研究人员推测其可能缓解PFAS诱导的肠道炎症。

本研究采用原代小鼠腹膜巨噬细胞（PMs）和慢性结肠炎小鼠模型，评估并比较了三种典型PFAS化合物（PFOA、PFNA和PFDA）在不同浓度下对关键炎症因子IL-1β和IL-18表达的影响，并探究其潜在分子机制。体外结果显示，PFOA在所测浓度范围内对细胞活力和炎症因子表达无显著影响；PFNA在低浓度（0.1–1 μM）下即显著上调IL-1β和IL-18的表达，且呈剂量依赖性；PFDA则主要在高浓度下激活炎症通路。机制研究表明，低剂量PFNA特异性激活caspase-11依赖性非经典NLRP3炎症小体通路，而高剂量PFNA则激活外源性凋亡通路，呈现双相剂量反应。进一步的caspase-11敲低和泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理均能显著抑制PFNA诱导的NLRP3炎症小体相关蛋白表达和细胞毒性。分子对接和分子动力学模拟预测PFNA可与pro-caspase-11结合，结合能为-8.40 kcal/mol，且复合物结构稳定。在体内慢性结肠炎模型中，PFNA暴露（1.01 μg/kg/d，持续24天）显著加剧了DSS诱导的结肠缩短、组织损伤和炎症细胞浸润，并上调结肠组织中caspase-11和NLRP3通路蛋白表达。杨梅素治疗（100 mg/kg/d，从第9天开始）有效逆转了PFNA诱导的上述促炎效应，抑制了caspase-11/NLRP3轴的激活。

主要研究结果分述如下：（1）三种典型PFAS对PMs促炎因子的影响比较：CCK-8实验显示，PFOA在0–100 μM范围内不影响细胞活力，而PFNA和PFDA分别在1 μM和10 μM浓度下显著降低细胞活力。PFNA在1 μM时诱导IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白水平达峰值，PFDA在高浓度时上调IL-1β但抑制IL-18蛋白表达。（2）低剂量PFNA通过caspase-11介导非经典NLRP3通路：低浓度PFNA（0.1–1 μM）剂量依赖性上调caspase-11表达，并显著增加NLRP3、GSDMD、N-GSDMD和cleaved-caspase-1水平，免疫荧光进一步证实了上述蛋白的表达上调。（3）caspase-11敲低或泛caspase抑制的验证：siRNA介导的caspase-11敲低显著抑制PFNA诱导的NLRP3、cleaved-caspase-1、GSDMD、N-GSDMD、pro-IL-1β、cleaved-IL-1β和IL-18的蛋白水平升高，并恢复细胞活力；Z-VAD-FMK预处理同样降低N-GSDMD、cleaved-IL-1β和IL-18的水平。（4）分子对接与动力学模拟：PFNA与pro-caspase-11的ARG-360残基形成氢键，结合能为-8.40 kcal/mol，100 ns分子动力学模拟显示复合物结构稳定。（5）杨梅素对PMs中PFNA诱导炎症的保护作用：杨梅素（25 μM）预处理显著抑制PFNA诱导的caspase-11、IL-1β、IL-18 mRNA和蛋白表达，并降低NLRP3、GSDMD、N-GSDMD、cleaved-caspase-1等下游蛋白水平，同时恢复细胞活力。（6）体内慢性结肠炎模型验证：PFNA暴露组小鼠结肠长度显著短于DSS模型组，组织学评分升高，浸润炎症细胞增多，结肠组织中pro-caspase-11、cleaved-caspase-11及NLRP3通路分子表达上调；血清IL-1β和IL-18水平升高。杨梅素治疗显著改善结肠长度和组织损伤，降低血清炎症因子水平，并抑制caspase-11/NLRP3通路激活。（7）单独对照实验显示，PFNA或杨梅素单独处理不引起显著体重和结肠长度变化，排除其非特异性效应。

讨论部分指出，PFNA在低浓度范围内（0.1–1 μM）可显著影响IL-1β和IL-18的表达和激活，这一浓度范围与人群血清PFAS水平（20 nM–215 μM）及PFNA可达352 nM的报道具有相关性。肠道微生物群可高效积累PFNA，使细胞内浓度达到环境暴露水平的25–60倍，提示肠道局部PFAS暴露浓度可能远超血清水平，因此本研究选用的剂量具有环境和研究意义。与人类caspase-4/5不同，小鼠caspase-11不能直接处理促炎细胞因子，而是通过GSDMD孔形成和K?外流间接激活NLRP3炎症小体，本研究结果与此机制一致。分子对接和动力学模拟支持PFNA与caspase-11的优先结合，但这些计算结果为初步发现，仍需进一步实验验证。杨梅素的保护作用可能涉及抑制炎症启动或调节caspase-11表达的上游信号通路，但现有数据无法区分其是直接靶向caspase-11还是作用于上游途径（如ROS或NF-κB），需进一步研究。体内慢性结肠炎模型中，PFNA在整个DSS处理及恢复期持续给药，更接近人类通过污染食物和饮水持续低剂量暴露的现实情况。研究的局限性包括：仅使用雄性小鼠，无法推广至雌性；受限于抗体可用性，未直接评估caspase-11在体内的细胞定位，而是以cleaved-caspase-1作为炎症小体激活的功能指标。

研究结论表明，低剂量PFNA暴露通过巨噬细胞中caspase-11依赖性非经典NLRP3炎症小体通路促进炎症，从而加剧IBD进展。杨梅素可有效减轻PFNA诱导的炎症，支持其对PFNA相关肠道炎症的保护作用，并可能作为caspase-11/NLRP3炎症小体轴的潜在干预措施。该研究为理解PFNA诱导的肠道毒性提供了有用的框架，并强调了调节caspase-11/NLRP3炎症小体通路的策略。通过将caspase-11相互作用的推定分子起始事件（MIE）与NLRP3炎症小体激活的关键事件（KE）以及肠道炎症加剧的有害结局（AO）相关联，该研究为其他PFAS化合物的特异性研究提供了类似AOP（ adverse outcome pathway）的框架，支持PFAS加剧IBD的风险评估和靶向干预策略制定。