用于创伤性脑损伤蛋白生物标志物检测的新型高容量干血浆生物采样-侧向流装置的评价

《Journal of Advanced Research》：Evaluation of a novel high-capacity dry plasma biosampling-lateral flow device for the testing of traumatic brain injury protein biomarkers

　　

摘要

背景与目的

当前基于血液的创伤性脑损伤（TBI）诊断检测，例如检测UCH-L1和GFAP的方法，需要采集静脉全血或血浆样本并进行冷链处理。目前尚无FDA批准的TBI检测设备支持毛细血管血或干燥样本形式。研究人员建议将一种新型干血浆采集设备纳入未来的TBI诊断工作流程中。该形式兼容指尖采血，简化储存和运输，减少生物采样负担，并保留关键TBI生物标志物的可检测性。该研究评估了该设备的分析性能，重点关注不同储存条件下的生物标志物稳定性及其与多重TBI生物标志物检测的兼容性。

方法

将毛细血管血（50–70 μL）或存档血浆施加到干血浆生物采样-侧向流（Dried Plasma Biosampling Lateral Flow, DPB-LF）设备上。该设备通过细胞过滤器将血浆分离到硝酸纤维素条上。空气干燥30分钟后，样本与干燥剂一起在不同温度和时长下储存。随后，将干燥血浆复水并使用Quanterix Neurology 4-Plex B检测进行分析，并将生物标志物水平与匹配的湿血浆样本进行比较。

结果

使用健康对照者的毛细血管血，DPB-LF设备展示出一致的血浆分离效果。SDS-PAGE分析显示干燥血浆与湿血浆的蛋白质谱相似。作为原理验证，将TBI患者和健康对照者的混合血浆样本施加到DPB-LF设备上，并在不同温度（4 °C、室温、40 °C）和时长（1、7、14、21天）下储存。复水后，干燥TBI血浆样本在4 °C下所有时间点以及室温下长达7天均持续产生GFAP、UCH-L1、NfL和Tau信号的稳健回收。延长的储存时间和升高的温度（室温下14–21天，或40 °C下7–21天）导致生物标志物信号回收的部分降低，这符合预期。此外，将16名老年TBI患者（GCS 13–15）的存档血浆样本施加到DPB-LF设备上。复水后，干燥样本中的生物标志物水平与匹配的湿血浆显示出强相关性，GFAP、NfL、Tau和UCH-L1的R²范围为0.829至0.995。研究人员还使用来自第二个独立队列的44名成人TBI受试者（GCS 3–15）在伤后第1天收集的血浆样本检验了DPB-LF设备。干燥血浆对计算机断层扫描颅内病变的预测能力稳健，GFAP、NfL、Tau和UCH-L1的AUC/ROC值分别为0.756、0.734、0.738和0.703。使用非参数Kruskal-Wallis检验，干燥血浆中测量的所有四种生物标志物水平也与损伤严重程度类别（GCS 3–8、9–12和13–15）显著相关。

结论

DPB-LF设备能够实现微创毛细血管血采集和稳定的干血浆储存，支持多重TBI生物标志物分析。该技术在临床和现场使用方面显示出前景，并在未来的TBI研究和诊断中具有潜在应用。

论文解读

创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因，每年约影响6900万人，相关经济成本超过4000亿美元。目前TBI的诊断和监测主要依赖计算机断层扫描（CT）以及基于血液的生物标志物检测。然而，现有检测方法通常需要静脉穿刺采血、快速处理以及严格的冷链运输和低温储存（如4 °C或?80 °C），在资源有限或现场环境中难以普及。尽管已有表面增强拉曼光谱（SERS）和电化学阻抗谱（EIS）等新型传感技术，能在实验室条件下实现高灵敏度检测，但它们仍需专门仪器和即时处理，并未解决样本采集、干燥稳定化和多平台兼容等核心问题。因此，研究人员开发了一种新型干血浆生物采样-侧向流（DPB-LF）设备，旨在通过指尖毛细血管血采集实现血浆分离与干燥储存，并兼容后续多重生物标志物分析。

该研究首先利用健康对照者的毛细血管血验证了DPB-LF设备的血浆分离能力。随后，将TBI患者和健康对照者的混合血浆样本加载到设备中，在不同温度（4 °C、室温、40 °C）和不同时长（1、7、14、21天）下储存，复水后使用Quanterix Neurology 4-Plex B检测分析胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经丝轻链（NfL）、Tau和泛素羧基末端水解酶-L1（UCH-L1）的水平。此外，研究纳入了两个独立临床队列进行验证：一是16例老年TBI患者（格拉斯哥昏迷评分GCS 13–15）组成的TRACK-GERI试点队列；二是44例成人TBI患者（GCS 3–15，伤后第1天）组成的Baylor医学院（BCM）验证队列。

在主要技术方法上，研究人员使用DPB-LF设备进行干血浆采集，通过硝酸纤维素膜和细胞过滤膜分离血浆并吸附蛋白。样本干燥后，使用含0.05% CHAPS的缓冲液复水洗脱。蛋白完整性通过SDS-PAGE电泳评估。生物标志物浓度利用Quanterix SIMOA高灵敏免疫检测平台测定。统计学方法包括双样本t检验、Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验、受试者工作特征（ROC）曲线及Bootstrap AUC比较。样本来源包括商业获取的健康对照和TBI血浆（BioIVT）、健康志愿者指尖血、TRACK-GERI老年队列以及BCM独立队列。

设备概念图与工作流程

DPB-LF设备由外壳和内置试纸条组成，包含三个功能区：顶层细胞过滤区用于拦截红细胞，中央硝酸纤维素膜区用于吸附并稳定血浆蛋白，底部吸水垫用于控制液体流动和吸收多余样本。毛细血管血通过指尖采血施加到设备上，空气干燥30分钟后密封于含干燥剂的铝箔袋中，可在不同温度下运输和储存。复水后即可用于后续分析。

使用DPB-LF设备的蛋白回收

来自健康对照者的新鲜毛细血管血经DPB-LF设备处理并复水后，SDS-PAGE显示其蛋白条带模式与湿血浆相似，主要蛋白条带（200 kDa至约10 kDa）均可回收。总蛋白回收率在健康对照样本中平均为59.91%（标准差5.65%），在TBI血浆样本中平均为57.02%（标准差7.07%），两组无显著差异，表明设备能有效保留血浆中的总蛋白。

不同储存条件下TBI和对照样本中生物标志物的稳定性与回收

在4 °C储存条件下，TBI样本的GFAP、NfL、Tau和UCH-L1水平从第1天至第21天保持稳定，未出现明显下降。室温储存时，TBI样本的生物标志物信号在7天内保持良好，但至21天出现部分降低，其中GFAP从超过2000 pg/mL降至775 pg/mL。40 °C高温储存导致更显著的信号衰减，TBI样本GFAP在第21天下降约69%，NfL下降约78%，Tau下降约86%，UCH-L1下降约33%。健康对照样本的变异性较大，但总体信号较弱，可能与低浓度下信噪比较差有关。这些结果表明，4 °C是最适长期储存条件，而室温短期（≤7天）储存不会造成显著信号损失。

老年TBI（TRACK-GERI）试点研究

TRACK-GERI亚队列共纳入16例65岁以上TBI患者，其中81.25%为CT阳性。湿血浆与复水干燥血浆的蛋白浓度平均回收率为91.6%。对于GFAP、NfL和Tau，干燥血浆与湿血浆水平无显著差异；UCH-L1在干燥血浆中回收率显著升高（Mann-Whitney U检验，P=0.0002）。在12例有湿血浆配对数据的样本中，GFAP、NfL、Tau和UCH-L1的线性相关系数R²分别为0.995、0.991、0.980和0.829，表明两种采集形式之间具有良好的一致性。值得注意的是，部分标志物（尤其是UCH-L1）的回收率超过100%，研究人员认为这可能与干燥复水过程降低基质干扰、暴露抗原表位有关，而非生物标志物真实浓度增加。

扩展样本量BCM TBI队列DPB-LF验证研究

BCM队列包含44例TBI患者（28例CT阳性，16例CT阴性）。在CT阳性与CT阴性组比较中，四种生物标志物在湿血浆和干燥血浆中均显示显著差异。ROC分析显示，干燥血浆对CT阳性损伤的预测AUC值分别为：GFAP 0.756，NfL 0.734，Tau 0.738，UCH-L1 0.703；湿血浆的AUC略高（GFAP 0.868、NfL 0.799、Tau 0.763、UCH-L1 0.766），但配对Bootstrap比较显示差异均无统计学意义。此外，按GCS严重程度分组（3–8、9–12、13–15），GFAP、Tau、UCH-L1在湿和干血浆中均表现出随严重程度递增的浓度梯度，组间差异显著；干燥血浆中的NfL未达到显著水平（P=0.0853）。

讨论与结论

DPB-LF设备的主要优势在于其微创性，仅需指尖毛细血管血即可完成采集，避免了静脉穿刺的疼痛和操作难度，尤其适用于老年人、血管条件差的患者以及院前或资源匮乏环境。该设备消除了对立即离心和持续冷链的依赖，使样本可在室温下短期运输和储存，简化了生物样本处理流程。4 °C是维持生物标志物稳定性的最佳条件，室温≤7天的储存窗口符合大多数现场应用场景。部分标志物回收率超过100%的现象，研究人员归因于干燥复水过程中血浆基质干扰减少和抗原表位暴露增加。研究的局限性包括老年队列样本量较小，以及UCH-L1回收率变异性较高；未来需要在更大规模、更多样化的队列中进一步验证设备性能，并优化其热稳定性和蛋白回收效率。

结论：DPB-LF设备能够实现微创毛细血管血采集和稳定的干血浆储存，支持多重TBI生物标志物分析。该技术在临床和现场使用方面显示出前景，并在未来的TBI研究和诊断中具有潜在应用。