桑树来源的内生贝莱斯芽孢杆菌通过重塑根系代谢和微生物组抑制灰霉病并促进桑树生长

《Journal of Advanced Research》：Mulberry-derived endophytic Bacillus velezensis suppresses gray mold and promotes mulberry growth via reshaping the root metabolism and microbiome

　　

摘要

引言
灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的重要真菌病害，威胁全球农业生产。由于化学防治面临诸多限制，利用芽孢杆菌（Bacillus）进行生物防治因其环境友好和促进植物生长的特性而受到关注。然而，其在桑树灰霉病防治中的生态学基础和应用潜力仍未被充分认识。

目的
本研究旨在评估桑树来源的内生菌株贝莱斯芽孢杆菌ZJU_268（Bacillus velezensis ZJU_268）的生物防治效果，并研究其对植物生长、根系相关微生物组和代谢谱的关联效应。

方法
将温室试验与基因组及比较基因组分析、扩增子测序、非靶向代谢组学，以及分离微生物和代谢物的功能验证相结合，以评估ZJU_268及其无细胞上清液（cell-free supernatant, CFS）对桑树幼苗的影响。

结果
本研究分离到一株桑树来源的内生细菌B. velezensis ZJU_268，该菌株表现出强抗真菌活性，并降低了桑树幼苗灰霉病的发病率。全基因组测序和比较基因组分析揭示了与根系定殖、胁迫适应和抗菌物质生物合成相关的菌株特异性区域和基因。活细胞和CFS均以剂量依赖方式显著促进种子萌发、幼苗生长和生物量积累。扩增子测序显示，ZJU_268及其上清液重塑了桑树根系微生物组，富集了有益细菌和真菌类群，同时减少了潜在病原成员。富集微生物群中的可培养成员对B. cinerea表现出强抗真菌活性，并促进桑树生长。代谢组学分析进一步表明，ZJU_268及其上清液与桑树根系显著的代谢变化相关，并伴有特定代谢物的积累，这些代谢物支持了代表性富集分离株的生长。

结论
本研究表明，ZJU_268通过直接拮抗活性、微生物组重塑和全生物（holobiont）水平代谢变化来抑制灰霉病并促进桑树生长，为可持续桑树病害管理提供了一种有前景的生物策略。

论文解读：桑树内生贝莱斯芽孢杆菌ZJU_268通过重塑根系代谢与微生物组抑制灰霉病并促进桑树生长

桑树是蚕桑业的重要经济作物，具有显著的药用价值，但其生产受到灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病严重威胁。该病原可侵染200多种植物，造成重大产量损失。当前主要依赖化学农药和抗性品种防治，但存在成本高、环境不友好和效果有限等问题。因此，探索可持续的替代防治策略至关重要。植物内生菌，特别是芽孢杆菌属（Bacillus）成员，因环境友好和促生特性受到广泛关注，其中贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）具有广谱抗真菌活性和植物促生潜力。然而，其在桑树-病原体系中的应用潜力及遗传基础仍缺乏深入研究。基于此，研究人员开展了本研究，相关成果发表在《Journal of Advanced Research》。

研究人员从约千年桑树根部筛选获得内生细菌ZJU_268，并通过基因组测序、比较基因组分析、扩增子测序、非靶向代谢组学以及微生物和代谢物的功能验证等多层次手段，系统解析了该菌株对桑树灰霉病的生物防治效果及其对根系微生物组和代谢谱的影响。研究证实，ZJU_268不仅能直接抑制病原菌，还通过重塑根系微生物群落和代谢网络促进桑树生长，为可持续病害管理提供了新策略。

关键技术方法方面，研究人员以桑树品种“桂桑12”（Guisang 12）幼苗为材料，首先采用温室盆栽试验评价生防与促生效果；结合全基因组测序和比较基因组学明确菌株分类及功能基因特征；利用扩增子测序（细菌16S rRNA V3-V4区、真菌ITS1/ITS2）分析根系微生物群落结构；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）非靶向代谢组学分析根系代谢变化；并通过可培养分离与功能试验验证关键菌株和代谢物的作用，同时利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证相关代谢通路基因表达。所有试验均在灭菌土壤和未灭菌自然土壤条件下进行。

研究结果分为四个主要部分。在“表型、基因组和内生定殖特征”部分，通过生长曲线、菌落形态、扫描电镜和透射电镜观察，结合16S rRNA、gyrB基因系统发育分析及平均核苷酸一致性（ANI）分析，最终将ZJU_268分类为B. velezensis。全基因组测序显示其含3.93 Mb环状染色体且无质粒，编码大量与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、生物膜形成和胁迫响应相关的基因，并含有菌株特异性次级代谢产物基因簇。绿色荧光蛋白（GFP）标记定殖试验表明，ZJU_268能有效定殖于桑树根表并侵入内部组织，随后向茎、叶系统迁移，根部是长期定殖的主要场所。

在“生物学功能”部分，体外对峙试验表明ZJU_268对多种植物病原真菌有强抑制作用，对灰葡萄孢的菌丝抑制率高达98.09%，扫描电镜观察到病原菌丝严重畸形。其无细胞上清液（CFS）在40–121 °C和pH 2–10范围内仍保持抗真菌活性。温室生防试验中，ZJU_268菌液和CFS处理使桑树灰霉病病情指数分别降至41.67%和66.67%，与化学农药对照相当，qPCR证实根内灰葡萄孢丰度显著降低。此外，菌液（10⁶ CFU/mL）和10倍稀释CFS显著促进种子萌发、幼苗根长、株高和生物量积累，且呈剂量依赖效应。

在“微生物组重塑”部分，扩增子测序显示ZJU_268和CFS处理显著改变了根系细菌群落结构，而真菌群落结构变化相对较小。属水平上，潜在病原菌如泛菌属（Pantoea）、Afipia、Rhizorhapis以及真菌Verruconis、Exobasidium等相对丰度下降，而链霉菌属（Streptomyces）、黄杆菌属（Flavobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）等有益细菌，以及枝孢属（Cladosporium）、节丛孢属（Arthrobotrys）、梅奇酵母属（Meyerozyma）等有益真菌显著富集。共现网络分析显示真菌网络连通性降低，细菌网络结构相对稳定。从处理组根部分离到223株细菌和42株真菌，其中假单胞菌科、鞘脂单胞菌科及枝孢菌科等分离株对灰葡萄孢具有强拮抗作用，并能促进桑树生长；且ZJU_268与这些富集分离株具有配伍性和联合拮抗活性。

在“根系代谢重编程”部分，非靶向代谢组学共检出3431个代谢物，处理组与对照组代谢谱明显分离，共鉴定出625个差异代谢物。ZJU_268和CFS处理显著富集了多种代谢物，如硫肌苷单磷酸、反式玉米素、L-半乳糖、尿苷和L-丝氨酸等。体外功能验证显示，这些代谢物在特定浓度下能促进代表性富集细菌和真菌的生长，但相同浓度下不促进灰葡萄孢扩展，其中L-丝氨酸和尿苷反而显著抑制病原菌。KEGG通路富集分析表明，差异代谢物主要涉及辅因子生物合成、ABC转运蛋白、嘌呤代谢和核苷酸代谢；ZJU_268组还特异富集植物激素信号转导、玉米素生物合成和苯丙烷生物合成等通路，qRT-PCR结果显示相关合成基因表达变化与代谢物水平基本吻合。

在讨论部分，研究人员指出，仅基于16S rRNA基因难以区分近缘芽孢杆菌物种，gyrB和ANI分析提供了更精确的分类依据。ZJU_268的作用机制并非单独依赖直接拮抗，而是通过全生物（holobiont）层面的微生物群落重构和代谢重编程共同实现防病促生。活菌细胞与无细胞上清液引发了不同的宿主代谢调控模式：CFS主要快速积累抗氧化代谢物如抗坏血酸，而活菌可能通过持续定殖诱导宿主代谢网络的变化。这些差异提示两种互补的保护方式。此外，ZJU_268在含有土著微生物的未灭菌自然土壤中仍能保持防病和促生效果，表明其具有良好的田间应用潜力。

研究结论可译为：总之，本研究表明贝莱斯芽孢杆菌ZJU_268可抑制桑树灰霉病并促进植物生长，同时伴随根系相关微生物组和代谢谱的协同变化。该菌株能够有效定殖桑树根系，降低灰葡萄孢引起的病害发生率，并在温室条件下增强植物生长。该菌及其无细胞上清液均与桑树根系微生物组重塑相关，表现为有益微生物类群的富集和潜在病原类群的减少。在全生物水平上，ZJU_268和CFS处理伴随桑树根系代谢重编程，包括经实验证明能支持代表性富集微生物分离株生长的代谢物变化。活菌和CFS处理引发的不同反应提示存在互补的保护模式。综合多组学分析结果，菌株ZJU_268可作为可持续管理桑树灰霉病的有前景的生物制剂。