《Journal of Chromatography B》：Assessment of the binding characteristics of three antagonists toward CysLTR1 by affinity chromatography
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•使用多种亲和色谱方法测量三种拮抗剂对CysLTR1的平衡与动力学特性•基于配体-受体在亲和色谱上的保留行为评估其结合特性•孟鲁司特 < 扎弗鲁司特 < 普卢司特的结合平衡常数与其对CysLTR1的抑制活性呈正相关引言药物与膜受体之间的相互作用参数与药物在体内的药效和作用持续
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使用多种亲和色谱方法测量三种拮抗剂对CysLTR1的平衡与动力学特性
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基于配体-受体在亲和色谱上的保留行为评估其结合特性
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孟鲁司特 < 扎弗鲁司特 < 普卢司特的结合平衡常数与其对CysLTR1的抑制活性呈正相关
引言
药物与膜受体之间的相互作用参数与药物在体内的药效和作用持续时间密切相关，是药物发现与开发过程中评价药理活性的重要指标。基于核磁共振波谱、X射线晶体学、荧光滴定光谱、等温滴定量热法和圆二色谱等常规技术，平衡与动力学分析及热力学分析常被报道用于受体-配体相互作用研究 [1]，[2]，[3]，[4]。然而，这些方法需要大量高纯度样品，因此分析前的耗时且耗资的制备步骤不可或缺。生物模拟色谱法（有时也称为生物亲和色谱法）作为一种新兴技术，利用"生物相互作用"来筛选新药并从复杂体系中分离特定目标分子 [5]，[6]，[7]。该技术需要将蛋白质、受体、酶、核酸、磷脂或活细胞等生物靶标通过共价键连接到固体载体上作为固定相，与流动相中pH 7.4的水-有机混合物中的分析物相互作用 [8]。通常，某些亲和标签被融合到蛋白质中，所得融合蛋白可以以位点特异性共价方式将定制基团连接到固体基质表面 [9]，[10]。当目标蛋白质被固定在固定相材料上时，它们可以选择性和有效地结合配体，从而预测化合物的体内分布行为，并辅助选择最佳化合物进行进一步研究，使其成为药物分子。
更常用的技术，如表面等离子体共振（SPR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），也已被用于评估药物-蛋白质相互作用中的结合情况 [11]。SPR涉及将一种反应物（蛋白质或受体）固定在金属表面上，并监测其与溶液中另一种成分（药物）在流经表面时发生的相互作用。SPR无需标记，能够实时定量测量药物-蛋白质结合的动力学和亲和力。ELISA可以根据药物浓度对药物-蛋白质结合进行定量，从而得到结合曲线，数据可进一步分析以使用适当模型估算解离常数。SPR和ELISA均为非分离方法，通量适中，适用于测量与蛋白质的弱、中等和强结合物，而亲和色谱是一种分离方法，具有高通量特点，可精确测量弱到中等亲和力。然而，SPR和亲和色谱中生物靶标固定在载体上的过程都需要考虑，因为固定过程可能会通过蛋白质变性、方向不当或在结合位点处产生空间位阻而影响蛋白质活性。ELISA不需要固定生物靶标，在测量结合参数方面比SPR和亲和色谱更灵敏。即便如此，越来越多的证据表明亲和色谱是测量配体-蛋白质结合参数的快速简便方法。
为描述吸附和解吸过程，人们开发了多种色谱模型，包括前沿色谱法、进样量依赖法、区域洗脱法、峰衰变法和非线性色谱法。前沿色谱法基于在装有固定于柱上的蛋白质的柱上连续输入配体，同时监测洗脱配体的量 [12]，[13]。配体对柱的饱和会导致特征性的穿透曲线，其中平均位置与柱的结合容量相关，同时可得到结合平衡常数和总结合位点数。进样量依赖法基于注射分析物的摩尔量与其保留因子之间的关系，仅提供药物-蛋白质相互作用的结合平衡常数和结合位点数 [14]。区域洗脱法和峰衰变法是两个动力学模型，用于确定分析物与固定生物靶标的动力学速率，但两者都需要消耗大量竞争剂或置换剂，导致成本效益和实验效率降低。在非线性色谱中，峰展宽和形状偏离源于结合速率常数与解离速率常数之间的差异，且偏离程度被认为是配体浓度和药物-蛋白质相互作用动力学的函数 [15]。与非线性色谱相比，前沿色谱法和进样量依赖法仅能获得平衡常数，区域洗脱法和峰衰变法仅能测定动力学速率常数，而非线性色谱可以同时测定结合平衡常数和解离速率常数。需要注意的是，这些模型应根据其理论假设在不同条件下应用。在实际操作中，这些模型相互补充，弥补了单一方法的局限性，很好地适用于药物-生物靶标相互作用平衡与动力学的测定。
半胱氨酰白三烯受体（CysLTRs）是G蛋白偶联受体（GPCRs）之一，在响应其内源性配体如半胱氨酰白三烯白三烯C4（LTC4）、白三烯D4（LTD4）和白三烯E4（LTE4）时激活细胞内信号通路 [16]。这些半胱氨酰白三烯通过人体中至少两种不同的受体介导其作用，分别称为半胱氨酰白三烯受体1（CysLTR1）和半胱氨酰白三烯受体2（CysLTR2） [17]。CysLTR1对多种来自不同结构类别的经典拮抗剂敏感，而CysLTR2介导的作用对大多数拮抗剂具有抗性，但可被Bay u9773拮抗。孟鲁司特 [18]、扎弗鲁司特 [19] 和普卢司特 [20] 等经典拮抗剂可抑制半胱氨酰白三烯的合成或阻断其通过CysLTR1激活在气道中产生的效应，缓解多种慢性疾病症状，尤其是支气管哮喘和过敏性鼻炎。鉴于涉及CysLTR1拮抗剂的药物疗效和药物机制的明确性，我们以三种拮抗剂为例，基于亲和色谱行为预测其受体结合潜力。
在本研究中，将重组人CysLTR1固定在硅胶上作为固定相材料填充色谱柱，采用前沿分析、进样量依赖法和非线性色谱三种实验模型来测量三种拮抗剂对CysLTR1的平衡与动力学。通过热力学分析估算三种拮抗剂对CysLTR1的结合特性，并通过分子对接方法进行进一步验证。
章节片段
化学品和仪器
粒径5.0 μm的硅胶购自中国科学院兰州化学物理研究所（中国兰州）。孟鲁司特、扎弗鲁司特和普卢司特标准品购自源叶生物科技有限公司（中国上海）。酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉和氨苄西林购自Sigma公司（美国密苏里州圣路易斯）。蛋白质Marker溶液（分子量15–116 KDa）购自上海碧云天生物科技有限公司。其他化学品如NaCl、DIEA、DMF等。
CysLTR1基色谱柱的制备与表征
SDS-PAGE图像（图1A）显示，在Luria-Bertani培养基（LB）泳道中未观察到位于66.2 KDa和116.0 KDa之间、靠近蛋白Marker泳道中66.2 KDa处的明显条带，但在自诱导培养基（In）泳道中可以观察到。该条带可被指定为Halo标签标记的CysLTR1，因为其预期分子量为71.5 kDa，等于CysLTR1（38.5 kDa）加上HaloTag（33.0 KDa）之和。目标条带出现在细胞裂解液上清（S）泳道中，而非沉淀（P）泳道中，
结论
本研究使用前沿色谱法、非线性色谱法和进样量依赖法三种亲和色谱方法揭示了三种拮抗剂药物与CysLTR1的结合特性。三种方法相互补充，很好地确定了孟鲁司特 < 扎弗鲁司特 < 普卢司特的结合亲和力以及孟鲁司特 > 扎弗鲁司特 > 普卢司特对CysLTR1的解离速率常数。这些排序与
CRediT作者贡献声明
Yan Zhang：撰写 – 原稿，调查研究。Shiyu Wang：数据整理。Chaoni Xiao：撰写 – 审阅与编辑，资源提供。
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知可能影响本文所述工作的财务利益关系或个人关系。
致谢
本工作由陕西省重点研发计划资助（2024SF-ZDCYL-03-27）。
Yan Zhang|Shiyu Wang|Chaoni Xiao
