热浪期间奶牛乳中HSP70的日变化

《Journal of Dairy Science》：Daily variation in milk HSP70 in dairy cows during a heat wave

　　

摘要
在气候变化背景下，许多地区的热浪（HW）发生频率和严重程度不断增加，对奶牛的福利和生产性能构成挑战。生理和环境指标被广泛用于评估奶牛的热应激（HS）；然而，在生产条件下，热浪事件期间分子应激生物标志物的短期时间动态和滞后响应仍缺乏充分研究。本研究旨在评估热浪期间乳中HSP70的日变化，并分析其与环境温度-湿度指数（THI）以及传感器来源的网胃-瘤胃温度（RRT）之间的关联。研究在澳大利亚新南威尔士州卡姆登的一个基于放牧的奶牛场中，于连续5天的热浪期间开展，调查了20头临床健康、第3胎次的荷斯坦弗里西亚奶牛。每日在下午挤奶时采集乳样，使用竞争性ELISA检测HSP70。环境数据以1分钟间隔记录并计算THI，同时使用瘤胃丸传感器以10分钟间隔连续监测RRT。采用重复测量相关性分析和单变量线性混合模型，在样品采集前最长50小时的滞后窗口内分析THI、RRT与乳中HSP70之间的关联，并对多个滞后区间的检验进行多重比较校正。探索性分类性能采用受试者工作特征（ROC）曲线分析进行评估。结果显示，乳中HSP70与THI和RRT均存在延迟关联。乳中HSP70与THI的关联在热暴露后约40–50小时的延迟响应窗口内最强，重复测量相关系数范围为0.57–0.84。相应的混合模型分析在采用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）程序进行多重比较校正后仍显著（FDR校正P < 0.001），条件R2（R2c）值范围为43.79%–75.66%。类似地，与RRT的关联在热暴露后约48–50小时的延迟响应窗口内最强，重复测量相关系数范围为0.51–0.62，相应的混合模型分析仍显著（FDR校正P < 0.001），R2c值范围为40.92%–51.71%。相比之下，RRT对环境热负荷响应迅速，在约0–6小时的即时响应窗口内与THI的关联最强（重复测量r = 0.57–0.67），相应的混合模型分析仍显著（FDR校正P < 0.001；R2c = 48.15%–57.21%）。探索性分析确定乳中HSP70的临界值约为550 ng/mL，对RRT定义的HS具有0.782的敏感性和0.909的特异性。总体而言，研究结果表明，乳中HSP70在热浪暴露后表现出延迟响应模式，这与累积性细胞应激一致，并可为评估放牧系统中奶牛长期热应激提供环境和生理指标之外的补充信息。
解释性摘要：热浪日益威胁奶牛的生产性能和福利，而现有的热应激监测工具各有局限性。本研究表明，可在常规挤奶过程中非侵入性采集的乳中热休克蛋白70（HSP70）能够反映热浪期间与累积热负荷相关的延迟细胞反应，而非对短期环境条件的即时生理反应。通过将乳中HSP70与环境参数和瘤胃温度传感器相关联，研究结果强调了其作为补充性热应激生物标志物的潜力。该方法可能有助于牧场主和加工商更好地检测长期热应激，并在气候变暖背景下改进管理决策。

热浪期间奶牛乳中HSP70日变化研究的论文解读

**研究背景与问题**
热浪（HW）通常定义为连续至少3天出现异常高温的时期，其发生频率和强度在全球变暖背景下持续增加。澳大利亚南部高温事件的平均持续时间已从1960年的2天延长至2008年的4天，对奶牛养殖业构成严峻挑战。奶牛因产奶代谢负担高、热中性区窄，散热能力有限，长时间热负荷可导致采食量下降、产奶量减少、繁殖性能降低甚至死亡率上升。传统热应激评估主要依赖温度-湿度指数（THI）和核心体温指标，如网胃-瘤胃温度（RRT）。然而，THI反映的是群体水平环境暴露，无法体现个体生理差异及太阳辐射、风速等调节因素；RRT虽可连续反映内部热状态，但主要代表整体生理反应，对细胞层面应激过程缺乏洞察。已有研究表明乳中热休克蛋白70（HSP70）可作为非侵入性细胞应激指标，但多数研究采用单时间点采样，无法揭示热浪期间HSP70的逐日变化及其与环境、生理指标的滞后关联。为此，研究人员开展本研究，旨在评估热浪期间奶牛乳中HSP70的日变化，分析其与THI和RRT的关系，并探索其作为热应激生物标志物的分类能力。

**研究设计与技术方法**
研究于2023年12月在澳大利亚新南威尔士州卡姆登的悉尼大学Corstorphine奶牛场进行，该场采用放牧系统，无主动降温设施。根据澳大利亚气象局热浪服务定义，选取连续5天热浪期（最高气温30.71–42.10°C，THI值持续超过84），纳入20头临床健康、第三胎次荷斯坦弗里西亚奶牛。每日下午挤奶时采集乳样，利用竞争性ELISA检测乳中HSP70浓度；环境温度（T）和相对湿度（RH）以1分钟间隔记录并计算THI；瘤胃丸传感器以10分钟间隔连续监测RRT，数据经制造商专有算法校正饮水事件干扰。统计分析使用重复测量相关性描述时间滞后模式，并用单变量线性混合模型（以奶牛ID为随机效应）评估各滞后时间点（采样前0–50小时）THI、RRT与乳中HSP70的关联，采用Benjamini-Hochberg FDR校正多重检验。探索性分类性能通过受试者工作特征（ROC）曲线评估，以滞后50小时RRT≥39.5°C定义热应激状态。

**研究结果**
*环境与生理指标描述*
热浪期间日平均THI为71.03–77.92，峰值达84.89，热浪后期每日最低THI均≥68，表明持续高强度热负荷。RRT平均值在39.59–40.45°C之间，但多个热浪日最高值超过42°C，日内变异系数低（1.24%–2.78%）。乳中HSP70浓度在5个采样日平均值为458.89–858.74 ng/mL，变异系数12.48%–27.97%，其中3个采样日最大值超过1170 ng/mL。

*THI与乳HSP70的滞后关联*
时间滞后分析显示，乳HSP70与THI的关联在热暴露后40–50小时的延迟窗口内最强，重复测量相关系数为0.57–0.84；混合模型估计显示THI每升高1个单位，乳HSP70增加28.53–41.56 ng/mL，所有关联在FDR校正后仍显著（P < 0.001），条件R2（R2c）为43.79%–75.66%。

*RRT与乳HSP70的滞后关联*
乳HSP70与RRT的关联在48–50小时延迟窗口内最强，重复测量相关系数为0.51–0.62；RRT每升高1°C，乳HSP70增加193.73–207.00 ng/mL，FDR校正后均显著，R2c为40.92%–51.71%，且模型拟合随滞后时间延长略有改善。

*THI与RRT的即时关联*
相比之下，RRT（采样时刻RRT_t0）在0–6小时即时窗口内即对THI产生显著响应，THI每升高1个单位，RRT提高0.06–0.09°C，R2c为48.15%–57.21%，预测误差低（MAE约0.30–0.33°C，RMSE约0.39–0.41°C）。

*分类性能探索*
以滞后50小时RRT≥39.5°C定义热应激，ROC分析显示乳HSP70分类热应激的AUC为0.888（95% CI: 0.823–0.954），Youden指数确定最优阈值为约550 ng/mL，对应敏感性0.782、特异性0.909。

**讨论与结论**
本研究表明，乳中HSP70在热浪期间呈延迟响应模式，其与THI和RRT的强关联分别出现在滞后40–50小时和48–50小时，而RRT对THI的响应几乎即时（0–6小时）。这种时间差符合HSP70作为热休克因子的分子机制：长时间热应激导致蛋白质稳态破坏和氧化应激增加，经热休克因子介导的转录和翻译过程后，新合成的HSP70才释放到细胞外并进入乳中，因此乳中HSP70反映的是累积性细胞应激而非瞬时热反应。环境THI无法覆盖太阳辐射、风速及个体差异，RRT虽能实时反映核心体温，但瘤胃液体缓冲和饮水事件会造成短期温度波动。乳中HSP70的优势在于非侵入、可在常规挤奶时采集，不受挤奶厅设备限制。研究人员指出，约550 ng/mL的临界值应视为探索性结果，需在不同牛群、季节和管理条件下验证。局限性包括：仅在热浪期间采样，缺乏热浪前基线；环境数据来自距离牧场3.17公里的气象站，代表群体水平暴露；未记录个体产奶量，无法校正稀释效应；仅在一次热浪和单一时段（下午挤奶）采样，未评估日内变异。总体而言，该研究首次详细评估了热浪期间乳中HSP70的逐日变化，证实其具有作为放牧系统奶牛长期热应激补充性非侵入指标的应用潜力，可为农户和乳品加工商在变暖气候下改进热应激管理提供依据。该论文发表于《Journal of Dairy Science》。