日粮添加白藜芦醇改变奶牛瘤胃微生物组并减少尿中三甲胺/三甲胺N-氧化物排泄

《Journal of Dairy Science》：Dietary supplementation of resveratrol alters rumen microbiome and reduces urinary trimethylamine/trimethylamine N-oxide excretion in dairy cows

　　

摘要

三甲胺（TMA）是瘤胃胆碱代谢的主要产物。了解与TMA形成相关的微生物途径可能为改善瘤胃发酵效率和动物生产力提供机会；然而，有效调控瘤胃TMA产生的策略仍知之甚少。本研究结合体外和体内实验，探讨了白藜芦醇对奶牛瘤胃TMA产生及尿中排泄的影响。体外瘤胃发酵设置了4个白藜芦醇剂量（0、0.5、5和50 mmol/L）。与对照组（0 mmol/L）相比，5和50 mmol/L白藜芦醇处理组的TMA浓度显著降低。体内实验选用36头泌乳中期荷斯坦奶牛，平均泌乳天数（DIM）为171 ± 7 d，平均胎次为3.2 ± 0.4。实验持续5周，包括1周适应期和4周正式实验期。奶牛按胎次、产奶量和泌乳天数进行分组，然后随机分配到CON（基础日粮）、RES2.4（基础日粮+2.4 g白藜芦醇/头/天）和RES4.8（基础日粮+4.8 g白藜芦醇/头/天）三组。RES4.8组奶牛血浆和尿液中TMA和三甲胺N-氧化物（TMAO）的总浓度降低。白藜芦醇不影响干物质采食量、表观养分消化率和产奶性能，但改变了瘤胃发酵参数。白藜芦醇还增加了血清球蛋白和谷胱甘肽过氧化物酶水平，降低了血清IL-6、丙二醛和超氧化物歧化酶。宏基因组分析显示，白藜芦醇改变了细菌和古菌群落结构，但对原虫和真菌无显著影响。RES4.8组中普雷沃氏菌属（Prevotella）的相对丰度显著降低，而优杆菌属（Eubacterium_S）以及古菌目甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）和甲烷球菌目（Methanococcales）的相对丰度升高。功能分析表明，白藜芦醇不影响碳水化合物活性酶的整体组成，但降低了与氧化磷酸化、三羧酸（TCA）循环、萜类骨架生物合成、脂多糖合成和苯丙烷类生物合成相关通路的丰度。总的来说，这些发现为白藜芦醇介导的瘤胃功能调节和宿主TMA/TMAO代谢机制提供了新的见解。

白藜芦醇调控奶牛瘤胃微生物组与三甲胺代谢的机制研究——论文解读

一、研究背景与科学问题

畜牧业气味排放是可持续农业面临的重大挑战。在奶牛养殖设施中，三甲胺（TMA）是主要的恶臭化合物之一，具有鱼腥味和极低的嗅觉阈值（低至0.2 ppb），是农村和城郊地区气味污染的重要贡献者。奶牛舍外环境TMA浓度通常为几至几十ppb，其主要来源于奶牛尿液。当尿液与粪便混合时，尿液中的三甲胺N-氧化物（TMAO）可被粪便微生物迅速还原为TMA并释放到大气中，粪便-尿液混合区的平均排放速率达10至50 nmol/m²/s。据估算，全球奶牛场TMA年排放量可高达9.3 × 10⁷ kg。因此，减少TMA排放对于奶牛养殖中的有效气味控制和减少环境污染具有重要意义。

日粮胆碱被认为是奶牛胃肠道中TMA的主要前体物质。微生物通过胆碱利用基因CutC催化胆碱裂解为TMA和乙醛。在反刍动物中，瘤胃是TMA产生的主要部位，部分TMA可被甲基营养型产甲烷菌进一步利用，其余TMA被吸收进入血液并转运至肝脏，经含黄素单加氧酶氧化为TMAO，大部分TMAO随后经尿液排出。此外，肠道来源的TMA产生与人类心血管疾病相关，TMAO已成为相关病理的生物标志物，近期也有研究报道TMAO与奶牛脂肪肝病存在关联。虽然已有多种针对人类肠道产TMA菌的靶向抑制剂被报道，但能否调控奶牛复杂的瘤胃微生物群落尚不清楚，目前尚无直接针对减少奶牛胃肠道TMA产生策略的研究报道。

白藜芦醇是一种天然植物多酚，具有显著的抗氧化和抗炎活性，能够减轻反刍动物的氧化应激并增强免疫功能，还可改善生产性能和产品品质。已有研究表明，白藜芦醇可抑制小鼠肠道TMA产生，并能选择性抑制从人粪便中分离的胆碱降解菌。然而，白藜芦醇对奶牛瘤胃微生物群的影响及其减少奶牛TMA排放的潜力尚不清楚。研究人员假设，白藜芦醇补充剂可以调节瘤胃微生物群落并抑制瘤胃TMA产生，从而减少TMA和TMAO的尿排泄。该研究结合体外和体内方法，系统研究了白藜芦醇对奶牛生产性能、瘤胃发酵和微生物群以及血液和尿液中TMA和TMAO水平的影响，并采用宏基因组分析考察了瘤胃微生物组的分类组成和代谢功能变化。相关成果发表于《Journal of Dairy Science》。

二、主要技术方法

该研究采用了体外发酵实验和体内动物实验相结合的研究策略。体外发酵实验参照Zhou等（2021b）的方法，以瘤胃液为接种物，以20 mmol/L胆碱为TMA前体，设置0、0.5、5和50 mmol/L 4个白藜芦醇剂量处理，每个处理4个重复，并添加99 μmol/L硝化甘油作为产甲烷菌抑制剂。体内实验选用36头泌乳中期荷斯坦奶牛（平均泌乳天数171 ± 7 d，平均胎次3.2 ± 0.4），采用随机完全区组设计，按胎次、产奶量和泌乳天数分为3组：CON（基础日粮）、RES2.4（基础日粮+2.4 g白藜芦醇/头/天）和RES4.8（基础日粮+4.8 g白藜芦醇/头/天），预试期7 d，正式期28 d。样品采集包括瘤胃液、血液、尿液、粪便和乳汁。TMA和TMAO浓度采用牛ELISA试剂盒和气相色谱法测定。宏基因组测序采用Illumina NovaSeq 6000平台，经过质量控制和宿主序列去除后进行组装、基因预测和非冗余基因集构建，通过DIAMOND比对NCBI-nr和KEGG数据库进行物种和功能注释。

三、研究结果

体外瘤胃发酵结果：与对照组相比，5和50 mmol/L白藜芦醇处理几乎完全抑制了TMA产生（P < 0.001），而0.5 mmol/L处理无显著效果。白藜芦醇显著升高了发酵液pH，降低了总产气量、总挥发性脂肪酸（VFA）、乙酸、丙酸和异丁酸浓度（P < 0.001）。

干物质采食量、产奶性能和表观消化率：日粮添加白藜芦醇对DMI、产奶量和乳成分无显著总体主效应。但产奶量、4%乳脂校正乳（FCM）、乳蛋白和乳糖存在显著的处理×周交互作用（P < 0.05）。RES组（特别是RES4.8组）奶牛表现出更好的泌乳持续性。白藜芦醇对全消化道表观养分消化率无显著影响。

瘤胃发酵参数：与CON组相比，白藜芦醇补充显著提高了乙酸比例（P = 0.033），RES4.8组乳酸浓度显著升高（P = 0.002），氨氮浓度显著降低（P = 0.031），戊酸和异戊酸比例显著降低（P < 0.05）。pH、总VFA浓度、丙酸、异丁酸、丁酸和乙酸/丙酸无显著变化。

血浆和尿液TMA/TMAO水平：RES4.8组血浆TMA（P = 0.001）和TMAO（P = 0.021）浓度显著低于CON组，尿中TMAO浓度也显著降低（P = 0.005），而瘤胃液TMA浓度无显著差异。

血清生化、免疫和氧化应激指标：白藜芦醇显著增加了血清球蛋白浓度（P = 0.022），降低了白蛋白/球蛋白比值（P = 0.009）。RES4.8组白细胞介素-6（IL-6）浓度显著降低（P = 0.022）。白藜芦醇显著降低了超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）浓度（P < 0.05），提高了谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性（P = 0.027）。

瘤胃微生物分类组成：宏基因组测序共获得3.8 × 10⁹对原始读段，质控后保留2.1 × 10⁹对高质量读段。主坐标分析（PCoA）显示，白藜芦醇显著改变了细菌（ANOSIM：R = 0.164，P = 0.017）和古菌（ANOSIM：R = 0.134，P = 0.042）的群落结构，但对病毒、原虫和真菌无显著影响。RES4.8组中细菌门Elusimicrobiota、Patescibacteria、Fibrobacterota和Spirochaetota的相对丰度显著升高；优势菌属Prevotella显著降低（52.7% vs. 47.3%；P = 0.01），而Eubacterium_S及多个未分类属显著富集。古菌目中Methanobacteriales、Methanococcales和Methanomicrobiales显著升高。共现网络分析揭示Prevotella作为核心节点与多种其他菌属（如Methanobrevibacter、Phocaeicola等）呈显著负相关。

瘤胃微生物功能特征：KEGG功能分析显示，RES4.8组富集了DNA修复和复制相关通路（如碱基切除修复、错配修复），而萜类骨架生物合成、脂多糖生物合成、氧化磷酸化、TCA循环、苯丙烷类生物合成等通路在CON组富集。碳水化合物活性酶（CAZyme）谱在类水平（ANOSIM：R = 0.142，P = 0.037）和家族水平（ANOSIM：R = 0.148，P = 0.027）存在显著差异，dockerin基因相对丰度在RES4.8组显著降低。在VFA和甲烷代谢相关基因方面，RES4.8组中Krebs循环相关基因korABCD、K01676和sdhBC显著降低，而fumC升高；丙酮酸代谢通路中ldh和porADG显著升高，ME2显著降低；Wood-Ljungdahl通路中fhs、fdhAB、fwdBE、ftr、mch和mtd显著升高；产甲烷相关基因mcrG、K00400、mtrA和hdrA2显著升高。

四、讨论与结论

讨论部分指出，白藜芦醇对瘤胃发酵的抑制作用与剂量密切相关，高剂量在短期封闭批次体外模型中抑制瘤胃发酵，但能有效减少TMA形成。体内实验中，白藜芦醇虽未显著影响瘤胃TMA浓度，但显著降低了血浆TMA/TMAO和尿中TMAO水平，这反映了微生物TMA产生、宿主吸收、肝脏氧化和尿排泄的整体结果，可能是更敏感的TMA代谢变化指标。宏基因组分析表明白藜芦醇主要通过调节细菌和古菌的组成来影响瘤胃微生物生态系统功能。Prevotella丰度的降低可能与其对白藜芦醇的敏感性有关，而产甲烷菌相对丰度的升高提示瘤胃产甲烷潜力可能增加，但需谨慎解读。功能基因变化与发酵参数改变相符，如乳酸和乙酸比例升高与ldh和porADG基因丰度增加一致。血清免疫和抗氧化指标的改善表明白藜芦醇增强了奶牛免疫功能和抗氧化状态。

研究结论表明，日粮添加4.8 g/头/天白藜芦醇降低了奶牛血浆和尿液中的TMA和TMAO浓度，且不影响生产性能。此外，白藜芦醇降低了氧化应激，改变了瘤胃细菌和古菌群落组成及预测的微生物功能谱。这些结果表明，白藜芦醇具有作为减少奶牛TMA排放的营养策略的潜力，但仍需进一步研究以确认其潜在生物学机制和长期反应。