基于乳清蛋白的饮料配方：以牛乳乳清蛋白分离物制成的酸性饮料稳定性图

《Journal of Dairy Science》：Whey protein-based beverage formulation: Stability diagrams for acidic drinks made with milk whey protein isolate

　　

摘要

乳清蛋白分离物可从奶酪乳清或直接通过微滤从脱脂乳中获得，从而制得牛乳衍生的乳清蛋白分离物（milk-derived whey protein isolate, mWPI）。然而，这两种蛋白质来源在酸性饮料应用中的差异仍需进一步研究。因此，本研究旨在通过绘制酸性饮料应用中的稳定性图来表征mWPI的功能特性。研究人员从一家商业制造商处获得两批mWPI粉末。将粉末在室温下复水30 min，随后于4°C储存过夜以确保完全水合，配制10%（wt/wt）储备液。将蛋白质浓度调节至2%、4%、6%、8%和10%（wt/wt）。随后将样品pH调节至3.0、3.5、4.0、4.5和7.0，并添加NaCl（0、5和10 mM）。低pH样品（≤4.5）在109°C加热3 s，而高pH样品（>4.5）在141°C加热6 s，然后快速冷却。研究人员分析了样品的浊度、粒径、聚集指数（aggregation index, AI）、可溶性蛋白含量、黏度和非变性PAGE。无论盐浓度如何，饮料在pH ≥ 3.5时从澄清转变为浑浊。pH 3.0至<3.5、蛋白质浓度为3%–10%的样品表现出最小粒径（<150 nm），并保持光学澄清。pH和盐浓度的增加促进了蛋白质去折叠、聚集和溶解度降低，导致浊度和黏度升高。总之，mWPI能够在蛋白质浓度高达约8%（wt/wt）时配制出澄清、稳定的酸性饮料。这些发现为设计具有改善稳定性和功能性的高蛋白酸性乳制饮料提供了实用框架。

解读性摘要：高蛋白酸性饮料因热加工过程中蛋白质不稳定而难以配制。本研究评估了牛乳衍生乳清蛋白分离物（mWPI）作为奶酪乳清分离乳清蛋白替代品的可行性，并绘制了不同pH、蛋白质和盐浓度下的稳定性图。饮料在pH <3.5、蛋白质水平高达约8%时保持澄清和稳定，而较高的pH和盐水平促进聚集，增加浊度和黏度。这些发现为乳制品行业配制具有更好澄清度、稳定性和消费者吸引力的高蛋白酸性饮料提供了实用的可视化指导。

基于乳清蛋白的酸性饮料稳定性：研究背景、方法、结果与结论解读

一、研究背景与意义

乳清长期以来被视为奶酪生产的低价值副产物，但随着乳品工业认识到乳清蛋白的营养与功能价值，乳清现已成为主要副产物，其产量随全球乳产量同步增长。液态乳清约含94%水分和6%总固形物，其中乳糖约4%、蛋白质0.8%–1%、矿物质0.5%–0.7%。常规奶酪制造中，牛乳经巴氏杀菌（如72°C、15–35 s）会导致部分乳清蛋白（约2.8%）变性。后续乳清加工还需额外热处理，进一步加剧蛋白质变性。变性诱发蛋白质聚集，导致溶解度、消化率、生物利用度及功能性能降低，并在酸性澄清饮料体系中引起黏度上升、浊度增加和沉淀，影响货架稳定性。此外，奶酪乳清含有糖巨肽（glycomacropeptide, GMP）片段，已知其在低pH饮料中促进聚集体形成。

膜分离技术的进步使得通过微滤从脱脂乳中直接分离乳清蛋白成为可能，从而制得牛乳衍生乳清蛋白分离物（milk-derived whey protein isolate, mWPI）。与奶酪乳清来源的蛋白质相比，mWPI在GMP、凝乳酶衍生肽和发酵剂残留物含量上存在显著差异。更重要的是，mWPI仅经历一次巴氏杀菌步骤，并在接近天然pH（约6.6）条件下加工，而奶酪乳清pH低于6.5，因此mWPI的蛋白质变性程度更低。由于不含GMP且热历史较短，mWPI在酸性体系中可能表现出更优异的稳定性，具有较低的聚集倾向。

先前Wagoner等（2015）建立了针对乳清蛋白饮料在pH 3–7、蛋白质浓度1%–10%范围内的稳定性图，这些图基于蛋白质溶解度、浊度和热转变，为饮料澄清度和稳定性提供了预测框架，但仅限于奶酪乳清蛋白。因此，本研究旨在以mWPI为蛋白质来源，开发酸性饮料的稳定性图，帮助工业界制造更理想、货架期稳定的酸性乳清饮料，并可能实现更高的蛋白质含量。

二、研究目的与实验设计

本研究旨在表征mWPI的功能特性，具体通过绘制酸性饮料应用中的稳定性图来实现。研究人员从商业制造商（Leprino Nutrition, Denver, CO, USA）获得两批mWPI粉末，代表两个独立实验单元。将粉末在室温下复水30 min，随后于4°C储存过夜以确保完全水合，配制10%（wt/wt）储备液。次日将样品恢复至室温，用去离子水调节蛋白质浓度至2%、4%、6%、8%和10%（wt/wt），并添加0.02%（wt/wt）叠氮化钠作为防腐剂。随后将样品分为5等份（每份300 mL），调节pH至3.0、3.5、4.0、4.5和7.0。再分为3等份（每份100 mL），添加不同浓度NaCl（0、5和10 mM）。用85%（wt/wt）磷酸调节pH至3.0、3.5、4.0和4.5（±0.02），用1 N NaOH调节至7.0（±0.02）。

热处理方法为：低pH样品（≤4.5）在油浴中加热至109°C保持3 s，高pH样品（>4.5）加热至141°C保持6 s，随后迅速冰浴冷却。所选时间–温度组合反映酸性饮料的商业相关热处理条件，并可与Wagoner等（2015）对奶酪乳清WPI的研究直接比较。处理后测定浊度、平均粒径、可溶性蛋白含量、聚集指数（aggregation index, AI）、黏度，并进行非变性PAGE和还原SDS-PAGE。统计上使用SAS Studio 9.4的PROC GLIMMIX评估蛋白质浓度、pH和NaCl浓度及其交互作用对响应变量的影响，Tukey检验确定处理间的显著差异（P≤0.05），并用PROC TEMPLATE生成等高线图以实现响应面可视化。

三、主要关键技术方法

本研究采用以下关键技术：动态光散射（dynamic light scattering）测定平均粒径；紫外–可见分光光度法在420 nm测定浊度；BCA蛋白测定法（Pierce BCA Protein Assay Kit）测定离心后上清液中的可溶性蛋白含量；紫外–可见光谱扫描（240–340 nm）计算聚集指数；使用Anton Paar MCR-92流变仪（锥板几何）在20°C、剪切速率0.1–200 s^-1条件下测定表观黏度（报告100 s^-1）；非变性PAGE和还原SDS-PAGE分析蛋白质组成与聚集状态。样本来源为商业制造商提供的两批mWPI粉末，所有样品均经过上述处理和分析。

四、研究结果

（一）浊度

浊度是酸性饮料的关键质量属性，强烈影响消费者接受度。研究中将420 nm吸光度<0.1视为澄清。结果表明，无论盐浓度如何，饮料在pH ≥3.5时从澄清转变为浑浊。在无盐样品中，恒定蛋白质浓度下浊度随pH升高显著增加；含5 mM NaCl样品呈现类似趋势。较高pH下的浊度增加可能源于pH与低酸性饮料所需更剧烈热处理的联合效应。在pH 3.0时饮料保持澄清，可能归因于酸诱导的蛋白质水解和聚集减少，以及pH≤4.5所需热处理较弱。此外，在高盐（10 mM NaCl）条件下，蛋白质浓度>4%时测得浊度相对较低，这可能是因为较大聚集体沉降导致浊度下降。

（二）平均粒径

粒径分布分为5个范围：<150 nm、150–250 nm、250–500 nm、500–1000 nm和>1000 nm。在0 mM NaCl下，pH 3.0至<3.5、蛋白质浓度3%–10%的样品粒径最小（<150 nm），与澄清外观一致。pH ≥3.5的饮料浊度>0.5且粒径≥250 nm。粒径≥1000 nm的区域主要出现在等电点附近（pH 4–6），表明广泛聚集。添加5 mM NaCl后，大粒径区域扩展到更宽pH范围（约4至<7）。添加10 mM NaCl进一步缩小最小粒径区域至pH≤3.5且蛋白质浓度>3%至<10%的条件，同时中等粒径（<1000 nm）区域扩大。最大粒径分别为19,179 nm（0 mM）、13,436 nm（5 mM）和9,086 nm（10 mM），表明增加离子强度减少了超大聚集体形成。

（三）可溶性蛋白

蛋白质溶解度是热稳定性的关键指标。在无盐条件下，恒定蛋白质浓度时pH <3.5溶解度最高，可能由于酸诱导水解和聚集减少。pH <4、蛋白质≤8%时观察到高溶解度（80%–100%），而10%蛋白质时溶解度下降，表明浓度依赖性聚集增加。与奶酪乳清体系相比，mWPI在高蛋白质浓度下表现出更宽的高溶解度区域，可能因其热变性较少且不含GMP。在等电点附近（pH约4.5–5.5）溶解度显著下降，pH超过6.0后溶解度改善。添加10 mM NaCl后，pH<3.5且蛋白质≤8%时溶解度最高，但中性pH下高溶解度区域比5 mM NaCl时更窄，归因于“盐析”效应。

（四）聚集指数（AI）

紫外–可见光谱显示，pH ≥4的饮料表现出更高吸收强度和更宽光谱峰，表明蛋白质去折叠和聚集增加。样品在pH>3.5时出现吸收最大值红移至约290–300 nm（通常乳清蛋白最大吸收在约280 nm），反映芳香族残基暴露和微环境变化。聚集指数图表明，在所有盐水平和蛋白质浓度下，pH≤3.5的饮料AI值<200，显示蛋白质去折叠有限；pH≥4时AI显著升高。

（五）黏度

在pH 3.0条件下，无盐样品中黏度随蛋白质浓度从2%增至8%仅从1.72±0.66 mPa·s缓慢升至2.82±0.03 mPa·s，无显著差异；10%蛋白质时黏度急剧升至101.24±105.10 mPa·s。5 mM NaCl呈现类似趋势。10 mM NaCl时，10%蛋白质的黏度达到566.98±312.99 mPa·s，远高于无盐和5 mM NaCl条件，归因于离子强度介导的电荷屏蔽促进蛋白质–蛋白质相互作用和网络形成。在10%蛋白质时，所有pH 3饮料表现出弱至强凝胶行为，尤其在较高盐浓度下。因此，mWPI配制可流动酸性饮料的最大蛋白质浓度建议约为8%（wt/wt）。

（六）凝胶电泳

非变性PAGE鉴定了β-乳球蛋白（β-LG）、α-乳白蛋白（α-LA）和牛血清白蛋白（BSA）条带，并在pH 7饮料中观察到聚集体，尤其是10%蛋白质样品。pH 3样品在凝胶底部出现大片蛋白质拖带，表明酸诱导水解，与较小粒径和澄清外观一致。还原SDS-PAGE显示未加热mWPI和pH 3饮料中β-LG、α-LA、BSA和残留酪蛋白条带清晰可辨，说明酸化和热处理未导致主要乳清蛋白广泛肽键断裂。而pH 7饮料经更高热处理后BSA条带消失，表明BSA比其他蛋白质对pH和热处理更敏感。

五、讨论与结论

讨论部分指出，酸性饮料中的浊度和粒径受pH、热处理条件、蛋白质浓度和离子强度（盐含量）强烈影响。低pH（<3.5）样品具有较高蛋白质溶解度和较小平均粒径，从而获得光学上更澄清的饮料，原因是蛋白质聚集减少且采用了较温和的热处理条件。当pH接近主要乳清蛋白等电区时，聚集增加，导致平均粒径增大和浊度升高。增加NaCl浓度通常通过屏蔽蛋白质间静电排斥促进蛋白质–蛋白质相互作用和聚集体形成，但在某些条件下盐也影响聚集体尺寸分布，同时影响浊度和沉淀行为。

研究结论：在本研究评估的条件下，牛乳衍生乳清蛋白分离物（mWPI）能够配制蛋白质含量高达约8%（wt/wt）的酸性饮料，同时保持可接受的澄清度和物理稳定性。基于实验数据建立的稳定性图提供了一个实用的可视化框架，用于理解pH、蛋白质浓度、热处理条件和离子强度对研究配方空间内饮料稳定性的影响。这些发现可作为开发和优化高蛋白、货架稳定的酸性乳制饮料的有用指南。未来研究应评估这些配方的长期储存稳定性，以确认其在商业储存条件下的货架稳定性。