《Journal of Electroanalytical Chemistry》：Advances in electrochemical methods for exocytosis analysis
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摘要大脑的复杂功能依赖于细胞间的通信，其中外分泌作用通过调节神经递质和其他信号分子的释放起着核心作用。因此，对外分泌过程的定量分析对于理解神经化学通信、神经回路的功能以及神经和精神疾病背后的机制至关重要。在分析方法中，电化学方法具有卓越的空间和时间分辨率及灵敏度，能够动态地观察单
摘要
大脑的复杂功能依赖于细胞间的通信，其中外分泌作用通过调节神经递质和其他信号分子的释放起着核心作用。因此，对外分泌过程的定量分析对于理解神经化学通信、神经回路的功能以及神经和精神疾病背后的机制至关重要。在分析方法中，电化学方法具有卓越的空间和时间分辨率及灵敏度，能够动态地观察单个细胞和单个囊泡水平上的外分泌事件，并有助于研究生理和病理过程中的多种神经机制。本文总结了用于研究外分泌过程的电化学方法的最新进展，重点介绍了两种互补技术：单细胞安培法（SCA）和细胞内囊泡撞击电化学细胞计量法（IVIEC）。我们首先概述了外分泌的主要机制模型，包括“亲吻-离开”模型、“完全塌陷”融合模型、“复合”外分泌模型以及最近提出的“亲吻-收缩-离开”模型。接着讨论了SCA和IVIEC的原理和方法学发展，强调了它们在探测囊泡内容物、释放比例和融合孔动态方面的互补能力。最后，系统地探讨了多种化学物质、环境因素和病理模型如何调控外分泌的不同阶段，从囊泡的合成和运输到融合和释放。最后，讨论了电化学分析在外分泌研究中的新兴进展和机遇，特别是在实现高性能方法、精确调控外分泌以及闭环神经调节方面的潜力。预计电化学方法的持续进步将有助于更深入地理解神经化学通信，并促进对与神经和精神疾病相关的病理外分泌过程的研究。
引言
大脑通过整合感觉输入、协调运动输出并维持高级认知功能（如学习、记忆和情绪）来 orchestrates a wide range of physiological functions。这些功能严重依赖于神经元之间的精确通信，而这种通信主要通过突触处的化学信号传递实现。神经递质（包括多巴胺（DA）、血清素（5-HT）、肾上腺素（E）和去甲肾上腺素（NE）作为主要的化学信使，在突触间传递信号。不同的神经递质参与各种生理过程，其失调会引发神经病理学变化。简而言之，神经系统的正常运作不仅需要神经递质的精确合成、储存和运输，还需要其在适当时间和地点的严格调控释放。因此，理解调控神经递质释放的机制对于生理学和病理学研究至关重要，它为探究神经通信原理和发展神经疾病治疗策略提供了基础。
在单细胞水平上，神经递质的释放是通过高度调控的外分泌过程实现的，即膜结合的囊泡与细胞膜融合并将内容物释放到细胞外空间。外分泌包括一系列协调的过程，如囊泡合成、运输、膜融合和内容物释放，这些过程共同支持细胞间通信、膜稳态和其他基本细胞功能。外分泌介导多种生理过程[1]，包括神经递质的释放[2]和激素调节[3]。外分泌的失调与多种神经和精神疾病有关，如帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）和抑郁症[4][5][6][7][8][9][10]。因此，人们投入了大量努力来阐明外分泌的分子机制和不同模式。这些研究揭示了外分泌在多种生理和病理过程中的作用（图1），包括性别差异[11]、酸中毒[12]、运动[13]、光热神经调节[14]、纳米塑料毒性[15]以及L-DOPA治疗等药理干预[16]。除了这些机制研究外，还开发了多种分析方法来研究囊泡释放。其中，电化学方法因其具有高时间分辨率和灵敏度而受到特别关注，为在单细胞和单个囊泡水平上动态观察外分泌事件提供了有力工具。
目前，已经开发出多种方法来研究外分泌，包括荧光显微镜[17]、光遗传学[18]和溶液态核磁共振（NMR）[19]。其中，电化学方法（尤其是碳纤维安培法）因其独特优势而被广泛应用。它们提供亚毫秒级的时间分辨率，可以实时检测单个囊泡的释放事件。电化学方法还支持专门的数据处理协议，用于量化单个囊泡和细胞的释放量。与基于荧光的方法不同，电化学检测不需要荧光标记，因此不易受到荧光团光漂白、细胞功能干扰等因素的影响。这些综合优势使电化学方法成为研究外分泌动态和定量分泌的强大工具。
在用于研究神经递质储存和外分泌的电化学方法中，单细胞安培法（SCA）和细胞内囊泡撞击电化学细胞计量法（IVIEC）作为两种具有不同分析能力的技术脱颖而出[20]（图1）。这两种技术在功能上是互补的。SCA能够实时监测细胞表面的单个定量释放事件，提供关于释放动力学和融合孔动态的详细信息；而IVIEC则直接探测单个细胞内囊泡的电化学可检测内容物，从而获取单个囊泡中储存的神经递质数量。通过从囊泡内容和细胞外释放两个互补的角度研究外分泌，SCA和IVIEC共同为量化囊泡储存、释放及其在不同生理和病理条件下的效率提供了有力框架。除了SCA和IVIEC之外，还有其他电化学方法（如快速扫描循环伏安法（FSCV）、安培法和电化学阻抗谱[21][22][23]）也被应用于研究神经递质动态和细胞过程。此外，这些电化学方法正与光学或光遗传学调控及电生理记录相结合，以实现多通道和高通量测量。将这些技术扩展到生理相关系统（包括原代神经元、脑切片和类器官）将进一步扩展它们在复杂生物学背景下的应用潜力。
本文全面总结了电化学分析在外分泌研究中的最新进展，重点介绍了SCA和IVIEC。我们首先概述了外分泌的主要机制模型，包括“亲吻-离开”模型、“完全塌陷”融合模型、“复合”外分泌模型以及新提出的“亲吻-收缩-离开”模型，并 current understanding of vesicle pool dynamics。接着详细介绍了SCA和IVIEC的原理、发展历史和应用，强调了它们结合使用在量化囊泡储存、释放比例和融合孔行为方面的作用。随后，系统地探讨了多种生理、药理和环境因素如何影响外分泌的不同阶段，从囊泡合成和运输到膜融合和内容物释放。最后，我们探讨了未来的发展方向，包括将电化学传感与光遗传学或光热调控相结合、开发高密度微电极阵列进行分析，以及将这些技术扩展到更生理相关的模型（如神经元、脑切片和类器官）。总之，这些进展预计将为囊泡动态和神经通信提供更定量和机制性的见解，同时有助于研究神经和精神疾病中的外分泌功能障碍。
章节摘要
外分泌机制
几十年的研究中，研究人员提出了三种主要的外分泌和囊泡循环机制：“亲吻-离开”模型、“完全塌陷”融合模型和“复合”外分泌模型。这些模式主要在囊泡与质膜融合的程度和方式上有所不同，从而影响囊泡内容物的释放动力学和数量。“亲吻-离开”模型中，囊泡与质膜之间形成短暂的融合孔，允许部分或调节性内容物释放，随后孔闭合。
用于研究囊泡释放的电化学技术
上述机制揭示了囊泡融合和再利用的动态复杂性，范围从“亲吻-离开”模型到最近提出的“亲吻-收缩-离开”模型。然而，在单囊泡水平上实时解析这些过程需要具有极高时间和空间分辨率的分析方法。传统的成像和电生理学方法提供的信息是间接的或静态的，无法满足时间和空间上的要求。
电化学方法揭示的多重因素对外分泌的影响
囊泡释放是细胞内物质运输和分泌的基本过程。首先，囊泡在内质网中合成并封装特定蛋白质或神经递质，随后被运送到高尔基体并沿细胞骨架定向运输。最后，在细胞内Ca2+浓度升高的驱动下，囊泡与目标膜融合。
总结与展望
总之，两种主要电化学方法SCA和IVIEC的发展使得在单细胞水平上对外分泌及其调控因素的研究更加全面。SCA可以实时监测融合孔和释放动态（毫秒级分辨率），而IVIEC可以在接近生理条件下直接量化囊泡中的神经递质含量。这两种互补技术共同构建了一个强大的分析平台。
CRediT作者贡献声明
Peiyu Chu:撰写——初稿、实验研究、数据分析。Cong Pan:撰写——审稿与编辑、监督、实验研究、资金获取、概念构思。Ping Yu:撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（P.Y.获得了22125406、22550002、T2596020和T2596021项目；C.P.获得了22304011项目）、北京自然科学基金（P.Y.获得了Z230022项目）、中国科学院青年基础研究项目（C.P.获得了YSBR-139项目）以及中国科学院科学仪器开发项目（C.P.获得了PTYQ2026YZ0030项目）的支持。
Peiyu Chu|Cong Pan|Ping Yu
